基于“心腎相關”的腎炎防衰液改善糖尿病腎臟病大鼠腎臟及心臟病理的研究*

北京中醫藥大學第三附屬醫院

朱碧秀 田哲菁 劉蘭英 王 蕊 李嬌艷 劉笑慈 高偉華 王 騰 蔡瑞怡 (北京100029)

提要 目的：研究基于“心腎相關”的腎炎防衰液對糖尿病腎臟病(DKD)大鼠的治療作用以及對腎臟及心臟病理的影響。方法：雄性SD大鼠40只，隨機分出假手術組10只，余30只通過單側腎結扎+鏈脲佐菌素(STZ)誘導成功建立DKD模型后，隨機分為模型組、貝那普利組、腎炎防衰液組(n=10)。治療組分別予以貝那普利1.0 mg/kg·d-1、腎炎防衰液16.3 g/kg·d-1灌胃，余2組予以等量0.9% NaCl溶液。連續給藥12周后，取血檢測肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)、血管緊張素II(AngII)；用HE、PAS、Masson染色觀察腎臟病理變化，HE、Masson染色觀察心臟病理變化。結果：腎炎防衰液組和貝那普利組的Scr、BUN、AngII水平相較于模型組均明顯降低，差異均具有顯著性(P<0.01，P<0.05)。在腎臟病理中，與模型組相比，治療組在HE、PAS、Masson染色中均體現出減輕腎病病理損害的作用；在心臟病理中，HE染色可見治療組能減輕心臟病理損害，而Masson染色各組均未見明顯纖維化組織。結論：基于心腎相關的腎炎防衰液能有效改善DKD大鼠腎功能，減輕其腎臟、心臟病理損害。

糖尿病腎臟病(DKD)是長期血糖控制不充分的既定并發癥，具有重大的醫學和社會負擔，其主要特征包括以蛋白尿，腎小球濾過率下降，高血壓以及心血管疾病發病率和死亡率的高風險。[1]盡管終末期腎病可能是DKD最可能的轉歸，但大多數患者實際上是在需要腎臟替代治療之前死于心血管并發癥。[2]據此，對其心血管并發癥的防治在DKD早期治療過程中就要予以高度重視。基于此，筆者以DKD模型大鼠為研究對象，驗證具有“心腎同治”功效的腎炎防衰液對本病有良好療效的同時，探析腎炎防衰液對DKD大鼠腎、心組織病理表現的影響，探討腎炎防衰液對其具體的改善作用，以期為臨床治療DKD提供新的實踐方法思路。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物：健康雄性清潔級SD大鼠40只，體質量(200±20)g，6～8周齡，大鼠來源為北京維通利華實驗技術有限公司。統一于北京中醫藥大學SPF級動物實驗室內恒定溫、濕度飼養。

1.1.2 干預藥物

1.1.2.1 干預用藥：腎炎防衰液(生黃芪、太子參、麥門冬、北五味子、山茱萸、鱉甲、牡丹皮、三七、金櫻子)，由北京中醫藥大學第三附屬醫院顆粒藥房提供。實驗前將顆粒劑混勻，溶于適量蒸餾水，使其配成含藥物1 mg/mL的中藥液，于4℃冰箱存放。

1.1.2.2 對照用藥：鹽酸貝那普利片(10 mg/片)，藥物來源為北京諾華制藥有限公司。實驗前將貝那普利充分研磨成細粉，加入適量蒸餾水，配成含藥物0.1 mg/mL西藥液，于4℃冰箱存放。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物模型的建立和分組：選用SD雄性大白鼠40只，給予普通飼料、自由飲水，適應性飼養1周，檢測隨機血糖、尿蛋白均陰性后稱重編號，根據隨機數字表法隨機分出假手術組10只，其余30只為造模組；大鼠造模成功后再隨機分為3組。經過2次分組，將所有大鼠分為假手術組、模型組、貝那普利組及腎炎防衰液組，每組10只，共4組。

具體造模方法：造模組手術前禁食12 h后，以3%戊巴比妥鈉溶液按0.15 mL/100 g腹腔注射麻醉，行左腎結扎術。方法：用棉球蘸碘伏在手術處消毒，左背中下部切口，使左室暴露在視野中，去除附著在腎上的脂肪及腎上腺，結扎左腎門血管，將腎放回體內，進行傷口縫合。假手術組術前予普通飼料，手術方式同模型組，暴露左腎后但不結扎左腎門血管，并重新回納腹腔，縫合切口。術后1周，造模組按40 mg/kg體質量 腹腔內注射鏈脲佐菌素(STZ)，72 h后尾靜脈取血測血糖，血糖高于16.7 mmol/L則確定為DKD模型制作成功。如血糖未達標，則補打STZ，重復尾靜脈取血測血糖，血糖高于16.7 mmol/L者確定為補打藥物的DKD大鼠模型制作成功。

1.2.2 喂養及給藥:(1)造模組普通飼料喂養，同時按以下方法給藥。①貝那普利組：予以貝那普利1.0 mg/kg·d-1(相當于人臨床劑量的6倍)從手術第2 d開始灌胃，每日1次，灌胃12周；②腎炎防衰液組：予以腎炎防衰液16.3 g/kg·d-1(相當于人臨床劑量的6倍)從手術第2 d開始灌胃，每日1次，灌胃12周；③模型組：予以等量0.9% NaCl溶液灌胃，每日1次，灌胃12周。(2)假手術組普通飼料喂養，給藥方式同模型組。

1.2.3 標本采集：造模成功則分別于給藥前、給藥2、4、8周后尾靜脈采血0.2 mL，監測血糖、體質量變化；代謝籠收集 24 h 尿，測尿量，血、尿標本皆離心(3 000 r/min、15 min)后取上清，EP管分裝，置-80°C 冰箱保存。各組大鼠于12周后實驗結束時用l0%水合氯醛(0.33 mL/100 g體質量)腹腔注射麻醉，腹主動脈取血，離心(3 000 r/min、15 min)后取血清，EP管分裝。一份待測生化指標，其余-80℃冰箱保存。在冰上用無菌無酶的器械完整剪下心臟，剝離心包膜，稱重，剖取1/4心尖部兩份，1份投于4%多聚甲醛溶液后分別石蠟、OCT包埋，行組織病理學及免疫熒光檢測，另1份放入凍存管，經液氮驟冷后保存于-80℃冰箱，待做相關蛋白定量檢測。在冰上用無菌無酶的器械完整剪下右腎，剝離腎包膜，稱重，縱剖留取2份皮質，1份固定于4%多聚甲醛溶液后分別石蠟、OCT包埋，行組織病理學及其他檢測。1份放入凍存管，經液氮驟冷后保存于-80℃冰箱，待做相關蛋白定量檢測。每組隨機抽取7只大鼠樣本進行檢測。

1.2.4 生化指標檢測：⑴ 血肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)的檢測(通過546 nm波長比色測定)。⑵血管緊張素II(AngII)的檢測(嚴格按照試劑盒說明書操作)。

1.2.5 腎臟、心臟組織病理學檢測：大鼠腎臟、心臟組織經固定、脫水、浸蠟、包埋后制成石蠟切片，進行HE、PAS、Masson染色，顯微鏡下觀察大鼠腎臟、心臟病理改變。

1.2.6 腎臟組織病理圖像分析方法：⑴ 腎小球硬化；⑵ 腎間質纖維化，對每份Masson染色的標本，在400倍光學顯微鏡下，腎皮質區選取5個不連續的不含腎小球和血管的視野并拍照，采用Image-Pro Plus 6.0 圖像分析系統對腎間質纖維化程度進行半定量評估，以腎間質綠色染色區為陽性目標區，計算陽性目標區與所測區域總面積比，并計算該動物腎間質纖維化陽性面積比的平均值。拍照采用盲法減少誤差。

1.2.7 數據統計：運用SPSS22.0軟件對各組數據進行分析。多組間比較時采用單因素方差分析，多重比較采用LSD法，方差不齊，采用Welch法校正，P<0.05認為差異具有顯著性。

2 結果

2.1 血清生化指標 ⑴相較于假手術組，模型組的Scr、BUN含量均顯著升高(P<0.01)，提示該組DKD大鼠腎小球濾過功能大幅減退；與模型組相比較，腎炎防衰液組和貝那普利組Scr及BUN水平明顯下降(P<0.01，P<0.05)，且腎炎防衰液組下降較貝那普利組更低，提示腎炎防衰液組具有延緩腎臟病變進展的功效。⑵相較于假手術組，模型組的AngII含量明顯升高(P<0.01)，提示DKD大鼠模型存在腎素-血管緊張素-醛固酮(RAAS)系統激活現象；與模型組相比較，腎炎防衰液組及貝那普利組AngII水平明顯降低(P<0.01)，且腎炎防衰液組下降較貝那普利組更低，提示與貝那普利作用相似，腎炎防衰液組可能具有抑制RAAS系統的功效。詳見表1。

表1各組DKD大鼠血清生化指標變化情況

2.2 腎臟組織病理學改變

2.2.1 腎臟組織HE染色病理學改變：本研究結果表明，假手術組大鼠腎小球完整清晰，腎小管結構完整規則；與假手術組相比較，模型組大鼠腎小球結構不清晰，部分腎小球出現變形、固縮, 血管腔和包曼氏囊腔明顯狹窄,甚至閉塞,系膜細胞和系膜基質增生明顯,偶可見腎小球硬化，同時伴有許多炎性細胞的浸潤，腎小管管腔增大，腎小管上皮細胞存在空泡樣變性；與模型組相比，腎炎防衰液組和貝那普利組腎臟損傷減輕，腎小球相對完整清晰，系膜細胞和系膜基質增生減輕，未見明顯腎小球硬化，腎小管水腫減退，炎癥細胞浸潤減少，小管上皮細胞空泡樣變性減少。見圖1。

圖1 各組腎臟組織HE染色病理改變(×400)

2.2.2 腎臟組織PAS染色病理學改變：本研究結果表明，假手術組大鼠腎小球完整清晰，腎小管結構完整規則；與假手術組相比較，模型組大鼠腎小球基底膜稍有增寬系膜細胞和系膜基質增生明顯, 與模型組相比較腎炎防衰液組和貝那普利組大鼠腎小球基底膜增厚情況好轉, 系膜細胞、系膜基質增生情況減輕。見圖2。

2.2.3 腎臟組織Masson染色病理學改變：本研究結果表明，假手術組大鼠纖維化面積很少。與假手術組相比較，模型組大鼠Masson染色腎間質偶有藍色膠原纖維組織大量出現,腎小球及腎小管時有藍染纖維組織。與模型組相比較腎炎防衰液組和貝那普利組大鼠腎臟組織纖維化面積明顯減少。見圖3。

圖2 各組腎臟組織PAS染色病理改變(×400)

圖3 各組腎臟組織Masson染色病理改變(×400)

2.3 心臟組織病理學改變

2.3.1 心臟組織HE染色病理學改變：本研究結果表明，假手術組大鼠心肌細胞排列整齊，結構清晰；較于假手術組，模型組大鼠心肌細胞體積增大，排列較紊亂，同時伴有炎性細胞浸潤，偶有空泡樣變性。與模型組相比較，腎炎防衰液組和貝那普利組大鼠心肌細胞增大情況好轉，排列較整齊，炎性細胞浸潤及空泡變性情況少見。見圖4。

圖4 各組心臟組織HE染色病理改變(×400)

2.3.2 心臟組織Masson染色病理學改變：考慮本研究各組大鼠成模時間短，DKD病變較輕，對心臟方面影響較小，故各組大鼠均未觀察到明顯藍染纖維化組織。見圖5。

圖5 各組心臟組織Masson染色病理改變(×400)

3 討論

DKD是現代醫學病名，查閱醫書典籍，雖無明確本病記載，但可從“腎消病”“消癉”等相關記錄中觀其蹤跡。隨著中醫規范化研究的深入，現代醫家根據其病因病機，及臨床證候特點，稱其為“消渴病腎病”，[3]認為是由消渴病久治不愈，濕熱痰瘀交結，積聚于腎絡引起。而消渴病腎病在心臟方面的并發癥相較于其他腎臟病發生率更高。心腎兩臟關系密切，根據其生理病理特性，在治療DKD同時，務必關注心臟。

本研究中腎炎防衰液藥物組成為：生黃芪、太子參、麥門冬、北五味子、山茱萸、鱉甲、牡丹皮、三七、金櫻子。其中，生黃芪甘溫益氣、健脾補腎；太子參甘平，補肺健脾、益氣生津；麥門冬甘寒養陰、清熱生津；北五味子酸收，配太子參補固正氣，伍麥門冬收斂陰津；鱉甲咸寒，軟堅散結、消散積聚；三七活血通脈，化瘀不傷正，配伍太子參及麥門冬，益氣養血、活血通絡；山茱萸溫補腎陽，以消陰翳；牡丹皮苦寒，清血分之熱；金櫻子味酸而澀,功專固斂，以防腎臟精微物質外泄。全方攻邪而不傷正，養正而不留邪，攻補兼施，以達溫補心腎、消癥散結、活血通脈之效。其中太子參臨床常代替人參，與麥門冬、北五味子三藥合為生脈散[4]，生脈散為益氣養陰代表方，補益心氣同時又可滋陰生津，以防心火過亢，耗傷腎水；現代醫學亦證實此方可以顯著減輕心肌細胞的增殖停滯和凋亡,同時對腎臟缺血性傷害有預防保護作用。[5-6]近年來研究發現[7-9]，消癥散結可以在糖尿病腎病及其他腎病中起到減少細胞外基質形成，抗腎小球硬化的作用。

關于腎炎防衰液具體療效，本研究選取了血生化指標及腎臟心臟病理作為研究對象來說明問題。Scr和BUN是腎臟疾病的重要指標。Scr因為與腎小球濾過率(eGFR)密切相關，能最直觀的反映DKD患者腎功能水平，對判斷DKD分期、指導治療十分重要。而BUN則與尿毒癥相關的多種臨床癥狀及并發癥的發生有著密切關系，故在臨床診療DKD中也有重要意義。本研究顯示，模型組大鼠的Scr、BUN均明顯升高，這表明其腎小球處于濾過功能減低狀態，而腎炎防衰液可以緩解這一狀態，從而使腎小球恢復正常狀態。而AngII是RAAS系統重要組成部分，也是導致DKD惡化的重要物質。本研究提示DKD大鼠模型存在RAAS系統激活現象，而腎炎防衰液可能具有抑制RAAS系統的功效，從而起到保護腎臟延緩DKD進展的作用。

在腎臟病理方面，本研究顯示，無論是HE染色、PAS染色還是Masson染色，腎炎防衰液對腎臟病理損傷具有多方面保護作用。如保持腎小球相對完整清晰，系膜細胞和系膜基質增生情況減輕，未見明顯腎小球硬化，腎小管水腫減退，炎癥細胞浸潤減少，腎小管上皮細胞空泡樣變性減少，預防纖維化等，且療效優于貝那普利組。

在心臟病理方面，各組大鼠的心臟病變相對較輕，腎炎防衰液對于此療效觀察并不明顯。查閱相關文獻，[9-11]考慮此次單側腎臟結扎聯合STZ誘導的DKD大鼠腎臟病變尚輕，其心血管并發癥相關危險因素暴露時間尚短，心臟組織病理損傷表現并不明顯，同時藥物灌胃時間短，導致對心臟方面改善亦較小。也許適當延長DKD大鼠飼養及灌胃時間可觀察到更確切的心臟保護作用。

故具有“心腎同治”效果的腎炎防衰液，在治療DKD過程中，在血生化指標及腎臟病理中，都能體現出其良好的治療效果，為治療本病提供新思路。