代謝性肝病中細胞的裂解性死亡

朱婭梅 馬世武

調節性細胞死亡(RCD)與炎癥性肝病有內在聯系，它支配著代謝性肝病的結局[1]。隨著代謝性肝病發展為炎癥、纖維化和肝硬化，不同類型的細胞死亡可能并存。除了非裂解形式的細胞凋亡(apoptosis)，肝細胞死亡還會裂解性壞死(lytic cell death)，即通過細胞膜通透性和細胞成分的釋放引起強烈的炎癥反應，有助于免疫細胞的募集和肝星狀細胞的活化。肝細胞死亡的調控是至關重要的，并為潛在治療干預提供了新的機會。本文結合近期Gautheron等發表的綜述[2]，討論裂解性死亡的RCD作用機制與肝臟疾病的病理生理相關性，總結在代謝性肝病中肝細胞不同RCD的最新認識，以及潛在治療應用。

一、細胞死亡分類與裂解性死亡

目前，細胞死亡分類基于功能方面的差異分為意外細胞死亡(ACD)和RCD。ACD即壞死(necrosis)，是不受控制的細胞死亡，由超過細胞調節能力的意外傷害刺激觸發，涉及細胞質和細胞器迅速膨脹，即脹亡(oncrosis)，以及質膜通透和隨后的損傷相關分子模式(DAMPs)的泄漏，從而導致細胞死亡發生；而RCD涉及效應分子參與的信號級聯反應，具有獨特的生化、形態特征和免疫學后果。RCD也可分為生理條件下的非裂解性死亡和裂解性死亡。程序性細胞死亡(PCD)即凋亡(apoptosis)，屬于非裂解性死亡，不會引發炎癥反應；而其余RCD模式，如壞死性凋亡(necroptosis)、細胞焦亡(pyroptosis)、鐵死亡(ferroptosis)等屬于裂解性細胞死亡[3-4](圖1)，表現為細胞內含物的泄露，可引發炎癥反應。壞死性凋亡、焦亡、鐵死亡與壞死雖有一定的形態學相似性，但可通過不同的可調控機制促進肝臟疾病的進展，且在誘導肝細胞死亡中可同時共存，有共同的重疊機制，以充當“后備”死亡策略。

圖1 細胞死亡方式分類

二、不同裂解性死亡的機制

(一)壞死性凋亡 Ray等[2]在1996年首次發現壞死性凋亡，它與壞死具有相似的形態學特征(早期包膜完整性破壞、細胞體積及胞內細胞器腫脹)，但其細胞死亡方式為可調控的、非caspase依賴性的PCD，即在caspase抑制的條件下，死亡受體(DRs)與配體結合，可觸發壞死性凋亡[5]。凋亡和壞死性凋亡均可由細胞膜上的DRs啟動，但是壞死性凋亡經歷由受體相互作用蛋白(RIP)介導的中間過程，這是將壞死性凋亡與其他依賴DRs的凋亡相區別的特點。Holler等證實FAS、腫瘤壞死因子受體1(TNFR1)、TNF相關凋亡誘導配體受體(TRAIL-R)等經典DRs誘導因子，可在caspase-8傳導失活、缺失或被抑制的特定情況下，觸發RIP/MLKL參與的細胞壞死性凋亡通路,胞內RIPK1和RIPK3通過關鍵的RIP同型相互作用基序形成復合體；再由RIPK3調控MLKL的磷酸化，導致MLKL寡聚化并轉移到質膜上形成膜孔；而RIP3的表達可增加促炎細胞因子表達，以及與炎癥小體激活相關；RIP3參與能量代謝并決定細胞凋亡和死亡之間的轉換。研究發現，caspase-8與RIP1和 RIP3 的交互表達可引起壞死性凋亡與凋亡的相互轉化[6]。活化的 caspase-8可裂解RIP1和RIP3，促使平衡偏向凋亡；而抑制caspase-8 則有利于RIP1和RIP3復合物組裝，形成壞死體 ( necrosome) ，誘導壞死性凋亡[7]。

(二)細胞焦亡 1992年，Zychlinsky等首次在志賀氏菌感染的巨噬細胞中觀察到了焦亡，它是依賴于GSDMD蛋白家族成孔活性的細胞程序性炎癥壞死, 在抵抗外部病原體入侵和感

知內源危險信號中發揮著不可替代的作用。焦亡由炎癥小體激活caspase-1的經典途徑和胞質脂多糖LPS激活caspase-4/5/11的非經典途徑而誘發。經典途徑始于胞質內的病原相關分子模式識別受體(PAMPs)和DAMPs識別各種外源性和內源性危險信號，并結合相應配體, 組裝成炎性小體激活caspase-1和caspase-4/5/11，進一步切割GSDMD為具有成孔活性的N末端GSDMDNT片段和C末端GSDMDCT片段，GSDMDNT片段會誘導質膜成孔，引發焦亡。而活化的caspase-1促進炎癥細胞因子( 如 IL-1、IL-18、IL-6 等) 、趨化因子、黏附分子等的成熟，并通過GSDMDNT在質膜中形成的孔被釋放到細胞外，募集并激活更多炎癥細胞，放大局部和全身的炎癥反應。非經典途徑依賴于LPS對caspase-4/5/11的活化，并獨立于炎性小體進一步切割GSDMD 蛋白促進細胞焦亡，還可激活NIRP3炎性小體誘導caspase-1的經典途徑促進細胞焦亡[2]。

(三)鐵死亡 2003年，在抗腫瘤藥物Erastin誘導腫瘤細胞死亡的研究中首次發現了鐵死亡，它是鐵依賴性，以脂質活性氧(ROS)堆積為特點的細胞死亡形式，可分為ROS的產生和執行鐵死亡兩個部分，涉及鐵代謝途徑、脂質代謝途徑和Xc-/GPX4三個途徑。鐵死亡主要發揮腫瘤抑制功能，其形態學特征是細胞體積縮小和線粒體膜密度增加，而沒有典型的凋亡或壞死表現。谷胱甘肽過氧化物酶4(GPX4)是生物膜抗過氧化損傷的主要保護機制，GPX4的直接或間接失活是誘導鐵死亡的經典途徑，而通過增加不穩定的鐵池來誘導是非經典途徑。Xc-轉運蛋白系統促進細胞攝取胱氨酸以合成GSH。GSH可在GPX4的作用下還原活性氧。Dixon等發現Eaststin可破壞Xc-轉運蛋白系統，GSH合成受抑制，細胞抗氧化能力降低，脂質活性氧堆積，引起細胞氧化性死亡，即鐵死亡。而非經典途徑中通過對鐵轉運相關蛋白的調控，鐵的蓄積會通過Fenton反應引起羥自由基的產生加劇氧化損傷。研究發現熱休克蛋白B1(HSPB1)通過抑制膜蛋白轉鐵蛋白受體1(TFR1)表達而降低細胞內鐵離子濃度。因此，過表達HSPB1會抑制鐵死亡，而血紅素氧合酶1則通過增加胞內鐵離子及活性氧，加速Eaststin誘導的鐵死亡。而體內脂質代謝失衡，尤其是不飽和脂肪酸的蓄積代謝會影響鐵死亡的靈敏性[4,8]。

(四)裂解性死亡的共性 與意外發生且不受控制的壞死不同，裂解性RCD有基因編碼的復雜調控機制，均可提醒免疫系統殺傷細胞，可清除病原體(即壞死性凋亡和焦亡)或癌細胞(即鐵死亡)，但長期刺激可導質過度炎癥損傷機體，參與肝病進展。DAMPs(包括HMGB1、熱休克蛋白、ATP和白介素)誘導長期慢性低水平的炎癥是RCD的標志，可被模式識別受體識別，模式識別受體(如TLR和NLR)也被用于誘導RCD。因此，DAMPs似乎是將各RCD途徑彼此連接的共同點。caspase-8在細胞死亡中有多重作用，可能是控制細胞凋亡、壞死性凋亡和焦亡的分子開關，并可防止組織損傷，除了在凋亡和壞死性凋亡中具有酶促作用外，還與MLKL一起調節巨噬細胞中的NLRP3炎性體活化。

三、不同代謝性肝病中的細胞裂解性死亡

(一)非酒精性脂肪性肝病 非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是一系列慢性肝病，從單純性肝臟脂肪變性到非酒精性脂肪性肝炎(NASH)，與肥胖癥和代謝綜合征密切相關。由游離脂肪酸超載引起的代謝改變是肝細胞損傷的主要原因，但從單純脂肪變性發展為NASH的機制尚未完全清楚。脂毒性、氧化應激、細胞器功能障礙和炎癥反應加劇了肝細胞氣球樣變，并加劇肝細胞死亡，而慢性肝細胞死亡可能會觸發免疫細胞募集和肝星狀細胞活化、肝細胞更新和克隆增生，這是一個驅動NAFLD進展的前饋回路。盡管以前將重點放在細胞凋亡和壞死上，但近來發現壞死性凋亡和焦亡與NAFLD和NASH發病機制有關[2]。

1.壞死性凋亡：在人類NASH中，發現了肝細胞壞死性凋亡相關的RIPK3和MLKL表達增加。在疾病活動者中，壞死蛋白RIPK1和MLKL的全身釋放支持該途徑在臨床NASH中的重要性。RIPK3和MLKL在肥胖和II型糖尿病患者內臟脂肪組織中的表達也增加，并與MLKL和代謝血清標志物相關。在糖尿病小鼠肝臟、脂肪組織和肌肉中，也檢測到高水平的壞死性凋亡的核心成分。使用RIPK1抑制劑或敲除MLKL，可預防小鼠胰島素抵抗和葡萄糖不耐受；對RIPK1、RIPK3或MLKL的特異性敲除和化學抑制劑，可激活胰島素刺激的AKT信號。在NASH實驗動物模型的肝臟中，RIPK3含量也增加，并且在蛋氨酸和膽堿缺乏(MCD)飲食喂養的小鼠中，抑制JNK可降低肝臟中的RIPK3水平，說明JNK的激活與RIPK3依賴性肝損傷和纖維化有關。RIPK3-MLKL介導的壞死性凋亡，還參與了脂肪肝的缺血再灌注損傷， MLKL-/-小鼠可降低肝臟中性粒細胞的浸潤和炎癥反應，而RIPK3-/-或RIPK3敲除對小鼠的遲發性缺血再灌注損傷有保護作用。雖然RIPK3缺乏可預防MCD飲食喂養小鼠的肝損傷、炎癥和纖維化，但會加劇肝臟脂肪變性和凋亡，以及高脂肪飲食誘導的脂肪組織炎癥、胰島素抵抗和葡萄糖不耐癥。然而，RIPK3-/-小鼠在高脂飲食中促進細胞凋亡的機制尚不確定，并且與先前在酒精模型中的結果相矛盾。如果肝細胞中RIPK3的缺失，不能直接決定肝細胞凋亡的增加，那么RIPK3的非實質性抗炎作用需通過條件敲除模型進一步分析。RIPK是細胞死亡的多效性調節劑，參與許多慢性疾病的發病機制，預防壞死體的形成和/或活化可能阻止NASH的疾病進展。研究發現高特異性RIPK1抑制劑RIPA-56能減輕飲食性肥胖小鼠的肝臟炎癥和纖維化，同時逆轉脂肪變性，抑制體重增加。同樣，MLKL的藥理抑制可降低NASH肝臟中新生脂肪的合成和趨化因子配體的表達。在人類NAFLD和NASH的研究中，利用壞死性凋亡的特征，以及條件基因敲除和更好地模擬與人類疾病相同程度的炎癥和纖維化的模型的干預研究，應該為NAFLD中壞死性凋亡的靶向治療相關性提供更多的方向[2]。

2.細胞焦亡：肝臟駐留庫普弗細胞活化和浸潤性巨噬細胞活化是NASH發病機制的顯著特征。當庫普弗細胞釋放TNF-α，進一步加劇炎癥和細胞凋亡的惡性循環，導致纖維化。但caspase-1、鼠caspase-11和人caspase-4/5等在炎癥研究中也起到重要作用，這提示了在NASH向NAFLD的發展過程中有焦亡的參與。炎癥性caspase的過度激活直接與人和小鼠的NAFLD發病有關，其中在焦亡過程中釋放的促炎細胞因子是關鍵的效應分子。事實上，炎癥小體下游IL-1β信號的激活，在NASH中驅動肝臟炎癥和纖維化，并放大其它細胞因子的反應。炎癥性caspase的另一個通用底物GSDMD是非典型炎癥小體激活的下游效應器，并在炎癥性caspase介導的焦亡中發揮特殊作用，具有內在焦亡誘導活性的GSDMDNT片段與NAFLD活動評分和纖維化呈正相關。Gsdmd-/-小鼠喂食MCD飲食，脂肪性肝炎顯著減輕，肝臟炎癥明顯改善，血清丙氨酸轉氨酶(ALT)水平和肝甘油三酯含量降低。此外，MCD喂養后，Gsdmd-/-小鼠的肝纖維化明顯減輕。有趣的是，Gsdmd-/-小鼠通過下調脂肪基因Srebp1c和誘導脂解基因，而防止脂肪變性。重要的是，即使沒有MCD處理，負責細胞焦亡的GSDMDNT結構域高表達也會自發地導致肝損傷，這表明GSDMDNT誘導的細胞焦亡是脂肪性肝炎發病的重要機制[2]。

3.鐵死亡：關于鐵死亡在NAFLD和NASH中的潛在作用的證據很少。然而，脂質過氧化的繼發產物，如丙二醛和4-羥基辛烯醛可作為NASH患者的氧化應激標記物，而維生素E可降低NASH患者的血清ALT。此外，由于代謝功能障礙而積累的游離鐵會加重NASH，例如在NASH患者中觀察到肝臟鐵質沉著，而原發性血色素沉著癥會加重NASH，如去除游離鐵可改善肝臟損害和血清ALT水平。在膽堿缺乏和補充乙硫氨酸(CDE)飲食模型中，鐵死亡抑制劑trolox和deriprone可抑制脂肪性肝炎發病時細胞死亡、炎性細胞浸潤和炎性細胞因子的表達。NASH患者的肝磷脂酰膽堿/磷脂酰乙醇胺比率降低，在CDE喂養小鼠的肝臟中，參與焦亡途徑的氧化磷脂酰乙醇胺增加，但在經過trolox治療后能恢復正常[2]。

(二)酒精相關性肝病(ALD)和酒精性脂肪性肝炎(ASH) 在ALD相關脂肪變性的早期，可能出現凋亡；而在ASH早期出現壞死性凋亡，進而發生鐵死亡，這與發生中性粒細胞炎癥、內毒素血癥和敗血病等ASH最常見的死亡原因相一致。

1.壞死性凋亡：在人ALD及小鼠暴露酒精后，參與壞死凋亡的RIPK3被誘導表達，RIPK3介導的壞死性凋亡和中性粒細胞介導的肝臟炎癥反應，也與終末期酒精性肝硬化患者的不良預后高度相關。相反，RIPK3缺乏可有效地防止灑精引起的血清肝酶異常、脂肪變性和炎癥。然而，抑制RIPK1激酶活性可減輕高劑量酒精引起的肝臟炎癥，但不能預防慢性酒精性脂肪變性和肝損傷，這表明酒精誘導的RIPK3介導的壞死性凋亡獨立于RIPK1起作用。給予姜黃素或沒食子酸治療，可通過抑制RIPK3和RIPK1表達，以及DAMPs釋放，來阻止灑精誘導的Nrf2表達下降。總的來說，在灑精誘導的肝損傷中，RIPK1、RIPK3和MLKL的作用仍有待進一步探索[2]。

2.細胞焦亡：細胞焦亡在ALD發病機理中起著重要作用。酒精攝入促進了內毒素釋放，從而激活了肝細胞中的NLRP3炎性小體途徑。相應的，NLRP3缺乏可改善酒精性肝脂肪變性和損傷。而在ASH患者和小鼠肝組織中，caspase-4/11分別上調。腸源性PAMPs和代謝源性DAMPs(ATP和尿酸)可引發細胞焦亡，并導致ALD患者及暴露灑精細胞，釋放依賴炎性小體的細胞因子。研究還發現ASH患者肝細胞中的caspase-1被激活，酒精可通過過表達硫氧還蛋白相互作用蛋白(a-arrestin家族的成員)引起caspase-1介導的細胞焦亡，該現象可被miR-148a逆轉。相反，在ASH患者或酒精喂養的動物肝臟中，miR-148a水平會被下調。肝細胞特異性釋放miR-148a還可減輕酒精性肝損傷。這些數據和巨噬細胞耗竭后血清ALT活性仍然升高的事實，支持了酒精對肝細胞中NLRP3炎性體活化的直接作用。盡管NLRP3炎性小體在免疫細胞和肝星狀細胞中的特定作用仍然值得討論，但細胞焦亡能夠刺激并有效維持ALD中的炎癥循環[2]。

3.鐵死亡：鐵的超載和增加的氧化應激已在ALD中得到充分證明。脂肪特異性脂質1(lipin-1)的過表達加速鐵積累，引起脂質過氧化，降低GSH和GAPDH，并加劇攝入酒精小鼠的肝臟損害，從而揭示了酒精誘導的肝損傷的潛在機制。Lipin-1是一種依賴于Mg2+的磷脂酸磷酸水解酶，參與磷脂和甘油三酯合成過程中二酰甘油的生成。然而，鐵死亡信號如何參與致病過程仍有待闡明[2]。

(三)其他代謝性肝病

1.血色病(hemochromatosis)：鐵超負荷疾病和遺傳性疾病(如尼曼-皮克病或高雪氏病)的細胞死亡的研究不多。鐵與許多人類肝臟疾病的發病機理有關，遺傳性血色病是由鐵引起的肝病的典型例子，鐵也是其他形式慢性肝病(包括NAFLD)進展的重要因素。鐵誘導的肝損傷可能會因并存的炎癥而加重，炎癥最終導致肝細胞死亡，并導致纖維化。遺傳性血色病是由蛋白質產物限制鐵吸收的基因突變引起的。因此，過量的鐵會產生ROS，從而導致細胞死亡和整體氧化損傷，最終導致嚴重的慢性并發癥，包括肝硬化。然而，鐵和鐵代謝在細胞死亡中的確切作用還不清楚。研究鐵穩態在SLC7A11介導的鐵死亡中的作用，發現鐵超載在胞內和胞外都會觸發鐵死亡。事實上，SLC7A11基因敲除不足以在基礎條件下誘發鐵死亡，但由于胱氨酸攝取受損和ROS生成增加，促進了鐵超載誘發的鐵死亡。因此，細胞鐵死亡是治療鐵過載相關疾病的潛在治療靶標。而在血色病和其他與金屬有關的肝病中，還需要探索其他裂解形式的細胞死亡[2]。

2.尼曼-匹克病(NPD)：又稱鞘磷脂沉積病，屬先天性糖脂代謝性疾病。C1型(NPC1)會導致溶酶體積累未酯化的膽固醇。臨床上，NPC1在新生兒中表現為膽汁淤積性肝病，或表現為以小腦性共濟失調和認知能力下降為特征的進行性神經退行性疾病。神經炎癥和壞死性凋亡參與了病理級聯反應。RIPK1活性的藥理和遺傳抑制延長了Npc1-/-小鼠和Npc1-/-/RIPK1激酶失活雙突變小鼠的壽命。然而，壽命的增加是適度的，這表明作為單一療法，RIPK1抑制治療的潛力是有限的。相反，與Npc1-/-/Ripk3-/-小鼠相比，PC1-/-/Ripk3-/-小鼠的存活率沒有增加。這表明雖然壞死性凋亡生在NPC1，但RIPK1的抑制作用可能與RIPK3在神經炎癥和細胞因子產生中的獨立作用有關。然而，證實了替代的RCD亞程序的作用，用caspase抑制劑或Bcl-2的神經元過度表達后，NPC1成纖維細胞的死亡并沒有減輕，證實了替代RCD亞程序的作用。更重要的是，最近已建議對NPC1 進行壞死性凋亡抑制和與2-羥丙基-b-環糊精的聯合治療[2]。

3.高雪氏病(Gaucher's disease)：壞死性凋亡似乎在其他溶酶體貯積病的病理級聯中起作用。高雪氏病是一種遺傳性代謝紊亂，由葡糖腦苷脂酶基因突變引起，也是最常見的溶酶體貯積病。Gaucher病小鼠神經細胞死亡是caspase非依賴性和非凋亡性的。與此形成鮮明對比的是，RIPK3介導的壞死性凋亡與Gaucher病的病理機制有關。事實上，在Gaucher病的小鼠和患者腦中，RIPK1和RIPK3水平顯著上調，但在從NPC1小鼠模型獲得的腦中，RIPK1和RIPK3水平沒有變化。這表明盡管腦炎癥和小膠質細胞活化是許多溶酶體貯積病的共同特征，但神經炎癥的途徑是疾病特異性的。此外，RIPK3的失活改善了高雪氏病小鼠的臨床病程，改善了存活率和運動協調性，并且對腦和肝損傷具有有益作用。RIPK3的消融導致CD68陽性庫普弗細胞減少，ALT活性降低，提示肝細胞損傷也有所減輕。具有改善的藥代動力學的壞死性凋亡抑制劑的開發可能為高雪氏病的替代治療方法鋪平道路，為此迫切需要創新的治療方法。其他RCD形式的具體參與尚待確定[2]。

四、結論和展望

肝細胞死亡是代謝性肝病發展的中心所在，不同RCD模式的發現以及作用機制的明確，有助于提高對肝病的病理生理認識，從而對肝病進行靶向治療。而基于當前的研究，在不同疾病中，細胞的裂解性死亡尚存在爭議及問題，仍需進一步的探索，但細胞裂解性死亡在代謝性肝病中的作用是毋庸置疑的，且在同一疾病中以一種死亡方式為主導，多種共存的方式互相影響，使肝細胞損傷機制更加復雜；而通過對不同死亡模式通路中的特異因子靶向治療，減少肝細胞死亡，延緩疾病的發展，給預防相關并發癥帶來新機會。