基于Cocktail探針藥物法分析辛伐他汀對肝臟藥物代謝酶的影響

李松 陳君

辛伐他汀是常用的調節血脂的藥物之一，廣泛地應用于高血壓的臨床治療中[1]。辛伐他汀通過選擇性抑制肝臟中膽固醇合成的限速酶——HMG-CoA還原酶，從而降低膽固醇的水平[2]。但是辛伐他汀在作為治療藥物，與一些藥物合并用藥時，會出現不良反應[3]。辛伐他汀主要經CYP3A4代謝，而CYP450的酶活性是藥物之間產生相互作用的重要機制之一[4]。本研究通過研究辛伐他汀對CYP450酶體內代謝活性的影響，為藥物相互作用研究提供參考，促進臨床合理用藥。

資料與方法

一、藥品與儀器

睪酮，批號100008-201206；奧美拉唑，批號100367-201305；美托洛爾，批號100084-20140，卡馬西平，批號100142-201105，均購自中國藥品生物制品檢定所；非那西汀，批號WXBB5767V；甲苯磺丁脲，批號MKBR6717V；氯唑沙宗，批號SLBD9318V，均購自Sigma公司，美國；乙腈，質譜純，德國Merck公司生產；超純水，Millipore Q自制。UPLC-Xevo TQD MS (超高效液相色譜-TQD質譜聯用儀)，ACQUITY系統，配置在線脫氣機、二元梯度泵、柱溫箱、自動進樣器，美國Waters公司。

二、實驗動物

雄性SD大鼠，體質量220±20g，實驗動物購自北京維通利華實驗動物技術公司，實驗動物生產許可證號：SCXK(京)2016-0006。飼養條件為：溫度，20±2 ℃；濕度，60%±5%；12 h晝夜交替。

三、實驗方法

(一)標準溶液配制 各探針藥物溶液配制：分別制備濃度為1 mg/ml的非那西汀、甲苯磺丁脲、美托洛爾、奧美拉唑、氯唑沙宗和睪酮的儲備溶液，均以乙腈作為溶劑。以乙腈為溶劑采用倍比稀釋法稀釋各探針藥物的儲備液，甲苯磺丁脲稀釋成濃度為50、20、10、5、2、1、0.5、0.2、0.1 μg/mL的工作液，氯唑沙宗稀釋成濃度為100、50、20、10、5、2、1、0.5、0.2、0.1 μg/mL的工作液，其余探針藥物稀釋成濃度為10、5、2、1、0.5、0.2、0.1、0.05、0.02 μg/mL的工作液，保存于4 ℃冰箱。內標溶液的配制：精密稱取卡馬西平，配制成濃度1 mg/mL的儲備液，稀釋成2 μg/mL的工作液，保存于4 ℃冰箱。

(二)Cocktail探針藥物溶液的配制 準確稱取探針藥物非那西汀22 mg，甲苯磺丁脲4.4 mg，美托洛爾、奧美拉唑、氯唑沙宗和睪酮各44 mg溶于4 mL無水乙醇，將無水乙醇緩緩加入18 mL生理鹽水中，配制成Cocktail探針藥物溶液。

(三)UPLC-TQD條件 色譜柱：Xbridge BEH C18 色譜柱 (2.1×50 mm, 2.5 μm)；流動相：0.5‰HCOOH-H2O (A), 0.5‰HCOOH-ACN (B)；流速：0.6 mL/min,；柱溫：40 ℃；梯度洗脫：0～1.5 min, 5%B; 1.5～3.5 min, 5%～45%B; 3.5～8.0 min, 45%～100%B; 8.0～11.0 min, 100%。離子化方式：電噴霧離子化(ESI)；離子檢測模式：多反應離子檢測模式 (MRM)。采用ESI正離子模式對非那西汀、甲苯磺丁脲、美托洛爾、奧美拉唑和睪酮進行定量；ESI負離子模式對氯唑沙宗進行定量。主要質譜參數：毛細管電離電壓3.2 kV，離子源溫度150 ℃ ，去溶劑氣N2，流速700 L/h，去溶劑氣溫度450 ℃。

(四)樣品預處理 取大鼠血漿樣本100 μL，加入內標溶液10 μL(終濃度為0.2 μg/mL)，加入300 μL乙腈，渦旋2 min，12 000 rpm離心15 min，取上清液于另一EP管中，置于真心離心濃縮儀中揮干，100 μL 50%甲醇溶液復溶，取3 μL進樣分析。

(五)方法學驗證 特異性和標準曲線：取6個來自不同大鼠的空白血漿樣品，通過考察空白生物樣品色譜圖、空白生物樣品外加探針藥物色譜圖及給藥后的生物樣品色譜圖，以反映本分析方法的特異性。分別取不同濃度的探針藥物工作液配制為混標，經過樣品預處理后，繪制標準曲線。

(六)實驗分組及給藥方法 將大鼠分為空白對照組和辛伐他汀組，每組6只，分別灌胃給予生理鹽水和辛伐他汀(4 mg/kg)，每日1次，連續給藥7 d；第8天灌胃給予“Cocktail”探針藥物溶液0.5 ml/100 g，劑量分別為非那西汀5 mg/kg ，甲苯磺丁脲1 mg/kg，氯唑沙宗，美托洛爾，奧美拉唑，睪酮10 mg/kg。

(七)血漿樣品采集 分別于灌胃給予探針藥物前及給藥后5, 15, 30 min, 1, 2, 3, 4, 6, 8, 12, 24 h眼內眥靜脈取血約0.5 mL至肝素化離心管中，3 500 rpm離心10 min，分離血漿，保存于-20 ℃冰箱待測。

三、實驗數據處理

采用Drug And Statistics Version 3.0(DAS 3.0)軟件計算各項藥代動力學參數，包括：達峰濃度(Cmax)、血藥濃度-時間曲線下面積(AUC0-t)、消除半衰期(t1/2)和清除率(CL)；實驗數據均以平均值±標準差表示。采用SPSS 14.0軟件進行統計分析，兩組間藥代參數進行獨立樣本t檢驗分析，P<0.05有統計學意義。

結 果

一、UPLC-MS方法學驗證

血漿中非那西汀、甲苯磺丁脲、美托洛爾、奧美拉唑、氯唑沙宗、睪酮及內標色譜峰峰型對稱，分離度高，且無其他雜質干擾；血漿中各探針藥物的線性范圍, 回歸方程和r值見表1。

表1 血漿中各探針藥物的線性范圍, 回歸方程和r值

二、Cocktail探針藥物血漿濃度測定結果

采用DAS3.0藥代動力學軟件對大鼠灌胃Cocktail探針藥物后的血藥濃度-時間數據進行處理，計算其藥代動力學參數值，結果顯示辛伐他汀組中非那西汀的Cmax和AUC0-t均顯著低于空白對照組，CLz/F顯著高于空白對照組(P<0.05)；辛伐他汀組中氯唑沙宗、甲苯磺丁脲和睪酮的Cmax和AUC0-t均顯著高于空白對照組，CLz/F顯著低于空白對照組(P<0.05)；辛伐他汀組和空白對照組中美托洛爾和奧美拉唑的Cmax、AUC0-t和CLz/F之間無顯著性差異(P>0.05)。見表2。

表2 大鼠灌胃給予Cocktail探針藥物后兩組主要的藥動學參數

討 論

CYP450酶參與了大多數內源性和外源性化合物的代謝，藥物的代謝速率和清除率依賴于其活性，但是CYP450酶可被多種藥物抑制或誘導，從而產生藥物-藥物相互作用，使得藥效降低或發生藥物不良反應[5]。其中CYP450酶亞型包括CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19、CYP2B6、CYP2E1、CYP3A4主要參與外源性藥物的代謝，且臨床上大部分藥物是經這些酶亞型代謝[6]。因此本研究選擇以上述酶亞型為研究對象，探討辛伐他汀對CYP450酶活性的影響。

目前研究藥物對CYP450酶活性的方法主要有探針藥物法和基因分型法。Cocktail探針藥物法是一次給予兩種以上探針藥物，評價藥物代謝酶活性的方法。相對于單一探針藥物評價方法相比，其具有可以降低個體間和個體內代謝酶活性差異的影響，同時還可以降低成本，縮短實驗時間等[7]。

本研究利用Cocktail探針藥物法研究辛伐他汀對CYP450酶活性，結果顯示辛伐他汀組中非那西汀的Cmax和AUC0-t均顯著低于空白對照組(P<0.05)；辛伐他汀組中氯唑沙宗、甲苯磺丁脲和睪酮的Cmax和AUC0-t均顯著高于空白對照組(P<0.05)；辛伐他汀組和空白對照組中美托洛爾和奧美拉唑的Cmax和AUC0-t之間無顯著性差異(P>0.05)。結果提示伐他汀對大鼠的CYP1A2有誘導作用，對CYP2C9、CYP2E1和CYP3A4有抑制作用，而對CYP2C19和CYP2D6無顯著性影響。他汀類藥物是臨床上廣泛使用的降血脂藥物，能減少內源性膽固醇的生物合成。辛伐他汀能有效地減少總膽固醇的水平，是治療高膽固醇患者的首選藥物之一[2]。辛伐他汀口服吸收后，其代謝產物具有活性，因此與一些藥物合并用藥時，會出現不良反應。辛伐他汀在與一些藥物聯用時，會影響其他藥物的體內藥代動力學參數，可能會造成這些藥物的藥效降低或不良反應的增加。如張師[8]對辛伐他汀對大鼠體內的吉非替尼藥代動力學影響進行了研究，結果顯示辛伐他汀會對吉非替尼的藥代參數造成影響。另有研究顯示辛伐他汀會顯著影響格列吡嗪的藥代動力學參數，造成其在血漿中暴露量明顯減少[9]。

綜上所述，本研究提示辛伐他汀應減少與其他通過CYP1A2、CYP2C9、CYP2E1和CYP3A4酶代謝的藥物同時使用，如同時使用需加強用藥監測，防止藥物相互作用可能造成的用藥不良反應。本研究結果可指導辛伐他汀相關的臨床合理用藥，為進一步研究藥物-藥物相互作用提供了基礎。