CXCL8及其受體在肺結核診斷中的臨床應用

邢志偉，張 珣，王 紅，韓云霄，張建武*

(1.河北省胸科醫院輸血科，河北 石家莊 050041；2.河北省胸科醫院檢驗科，河北 石家莊 050041)

結核病是最常見并可致命的一種傳染病，盡管目前全球在醫療技術方面取得了新進展，但結核病仍然是公共衛生方面的一項重要挑戰[1]。世界衛生組織報告2016年新增結核病1 100萬例，死亡140萬例[2]。由于結核病診斷方法的局限性，所以缺乏最佳診斷方法，臨床醫生仍然面臨著早期診斷的困惑[3]。結核病早期檢測在控制疾病和防止感染蔓延方面具有重要作用，引入新的診斷生物標志物有非常重要的應用價值[4]。CXC趨化因子配體8(cysteine X chemokine ligand 8，CXCL8)被認為是一種典型的趨化因子，屬于CXC家族，負責免疫細胞在炎癥部位的募集和激活。CXCL8在生理狀態下表達較少，但可由促炎性細胞因子如腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)和白細胞介素1β(interleukin-1β，IL-1β)等迅速誘導。CXCL8的功能主要依賴于其與特定細胞表面G蛋白偶聯受體CXC趨化因子受體1(cysteine X chemokine receptor 1,CXCR1)和CXC趨化因子受體2(cysteine X chemokine receptor 2,CXCR2)的相互作用。趨化因子在結核分枝桿菌的正常免疫應答中起著核心作用[5]，可以招募免疫細胞，是肉芽腫形成的絕對必要條件。本研究采用逆轉錄-聚合酶反應(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)測定活動性肺結核患者、潛伏性結核感染者及健康對照者外周血中CXCL8、CXCR1和CXCR2的mRNA表達水平，評價在肺結核診斷中的臨床意義。報告如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2017年3—12月我院結核科住院的初治肺結核患者(肺結核組)125例，男性77例，女性48例，年齡21～63歲，平均(40.2±11.7)歲，肺結核診斷參照中華人民共和國衛生行業標準(WS288-2017)，以病原學實驗室檢查為主，結合胸部影像學、流行病學、臨床表現及其他相關輔助檢查和鑒別診斷進行綜合分析作出診斷。根據影像學診斷，分為肺部形成空洞組31例，無空洞組94例；所有肺結核患者給予標準化治療，包括異煙肼、利福平、吡嗪酰胺、乙胺丁醇聯合強化治療2個月后，異煙肼、利福平鞏固治療4個月，即抗結核方案治療6個月。收集同期潛伏性結核感染109例，男性51例，女性58例，年齡22～65歲，平均(41.3±13.6)歲，細菌學檢測即痰涂片及培養確定陰性，結核菌素試驗陽性，有結核病接觸史，結合臨床癥狀及影像學表現無肺結核特征；同期體檢健康者(健康對照組)112例，男性65例，女性47例，年齡26～60歲，平均(38.9±10.5)歲。3組性別、年齡差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。所有研究對象排除糖尿病、高血壓、自身免疫性疾病等，無合并病毒性肝炎、獲得性免疫缺陷綜合征等傳染性疾病，均為漢族。

本研究經醫院倫理委員會批準通過，所有患者及志愿者簽署書面知情同意書。

1.2主要試劑 總RNA提取試劑Trizol LS購自Invitrogen公司。RT-PCR反應體系購自寶生物工程(大連)有限公司。RT-PCR上下游引物購自英濰捷基(上海)貿易有限公司。RT-PCR擴增儀(LightCycler 480Ⅱ，Roche公司)。

1.3檢測方法

1.3.1標本采集 所有研究對象空腹采集靜脈血4 mL，收集在乙二胺四乙酸抗凝管，3 000 r/min離心10 min，分離血漿置于-80 ℃冰箱保存。肺結核組于抗結核治療前、抗結核治療3個月及6個月收集標本。

1.3.2總RNA提取 分離所得的血漿中加入Trizol LS試劑，體積比為1∶3，操作步驟按說明書進行提取總RNA，最后室溫干燥RNA沉淀，加入無RNase的水溶解RNA，放-80 ℃冰箱保存備用。

1.3.3RNA濃度測定 RNA樣品于瓊脂糖凝膠中電泳，凝膠成像系統分析28 S和18 S兩條亮帶，如果260 nm和280 nm處光密度比值為1.8～2.0，即為合格RNA。

1.3.4RT-PCR實驗檢測各指標mRNA水平 RNA提取后首先反轉錄合成cDNA，嚴格按試劑盒說明書提供的步驟進行操作。以反應產物cDNA為模板進行PCR擴增，體系包括1 μL cDNA模板，2 μL 10倍PCR緩沖液(含Mg2+)，0.3 μL TaqDNA聚合酶(5 U/μL)，0.5 μL dNTP(10 mmol/L)，上、下游引物各0.5 μL(10 mmol/L)。CXCL8上游引物5′-CTTTGTCCATTCCCACTT-CTGA-3′，下游引物，5′-TCCCTAACGGTTGCC-TTTGTAT-3′，擴增片段長度為306 bp；CXCR1上游引物5′-CAGATCCACAGATGTGGGAT-3′,下游引物5′-AGCAGCCAAGACAAACAAACTT-3′，擴增片段長度為468 bp；CXCR2上游引物，5′-CTTTTCTACTAGATGCCGC-3′，下游引物5′-AGATGCTGAGACATATGAATTT-3′，擴增片段長度為417 bp；GAPDH上游引物5′-GACCAC-TTTGTCAAGCTCATTTCC-3′，下游引物5′-GTGAGGGTCTCTCTCTTCCTCTTGT-3′,擴增片段長度為323 bp。PCR擴增條件包括95 ℃預變性2 min，95 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸35 s，共38個循環后72 ℃延伸5 min。

1.4統計學方法 應用SPSS 22.0統計軟件處理數據。計量資料比較采用t檢驗、單因素方差分析和SNK-q檢驗，受試者工作特征(receiver operator characteristic curve，ROC)曲線分析評價診斷效能，計算曲線下面積(area under curve，AUC)。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1RT-PCR檢測各組CXCL8、CXCR1和CXCR2的mRNA比較 RT-PCR結果顯示，3組CXCL8、CXCR1和CXCR2的mRNA表達差異有統計學意義(P<0.05)。活動性肺結核組CXCL8、CXCR1和CXCR2的mRNA表達均明顯高于對照組和潛伏感染組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 RT-PCR檢測CXCL8、CXCR1和CXCR2基因表達比較Table 1 Relative values of gene expression in CXCL8,CXCR1 and CXCR2 by RT-PCR

2.2有無空洞肺結核患者CXCL8、CXCR1和CXCR2的mRNA表達比較 有空洞組肺結核患者CXCL8、CXCR1和CXCR2的mRNA表達顯著高于無空洞組，差異有統計學意義(P<0.05)，見表2。

表2 有無空洞肺結核患者CXCL8、CXCR1和CXCR2的mRNA表達比較Table 2 The expression levels of CXCL8, CXCR1 and CXCR2 in patients with pulmonary tuberculosis

2.3肺結核患者抗結核治療前后CXCL8、CXCR1和CXCR2的mRNA表達比較 治療3個月時CXCL8、CXCR1和CXCR2的mRNA表達水平均顯著低于治療前，治療6個月時CXCL8、CXCR1和CXCR2的mRNA表達水平均顯著低于治療前和治療3個月時，差異有統計學意義(P<0.05)。隨訪患者抗結核治療效果良好。見表3。

表3 肺結核患者抗結核治療前后CXCL8、CXCR1和CXCR2的mRNA表達水平比較Table 3 The expression levels of CXCL8, CXCR1 and CXCR2 in patients with pulmonary tuberculosis before and after anti-tuberculosis treatment

2.4ROC曲線 繪制肺結核組的ROC曲線(圖1)，CXCL8、CXCR1和CXCR2的AUC分別為0.888、0.819、0.756。CXCL8鑒別肺結核的敏感度和特異度分別為76.8%和90.5%，以1.0為臨界值;CXCR1的敏感度和特異度分別為72.8%和79.2%，以1.09為臨界值；CXCR2的敏感度和特異度分別為59.2%和78.8%，以1.08為臨界值。

圖1 CXCL8、CXCR1 和CXCR2在診斷活動性肺結核的ROC曲線A.CXCL8;B.CXCR1;C.CXCR2Figure 1 ROC curve of CXCL8, CXCR1 and CX-CR2 in the diagnosis of ac-tive tuberculosis

3 討 論

在先天和適應性免疫系統中趨化因子及其同源受體通過調節免疫細胞的激活和轉運發揮重要作用。趨化因子是一種小的分泌蛋白，含有4個至關重要的半胱氨酸殘基保持其結構完整性。根據這4個半胱氨酸殘基的排列將趨化因子分為CC、CXC、XC和CX3C，迄今為止，已鑒定出50種趨化因子和20種趨化因子受體[6]。

結核分枝桿菌主要通過呼吸道進入肺泡，被中性粒細胞、上皮細胞、肺泡巨噬細胞和樹突狀細胞等吞噬[7]，引起細胞介導的免疫反應，這些靶細胞分泌趨化因子CXCL8并啟動趨化因子和細胞因子等級聯反應[8]。CXCL8主要有2種生物學活性：趨化作用和白細胞活化，CXCL8可以通過影響包括結核分枝桿菌感染在內的嚴重傳染病的發病機制而產生重要的臨床效應。CXCL8的細胞外結合2個G蛋白偶聯受體介導其信號轉導，影響免疫細胞的增殖、存活及運動，促進多種細胞因子分泌，在炎癥、肺疾病、哮喘及腫瘤等多種疾病中發揮重要作用。CXCR1和CXCR2具有76%的序列同源性，以相似的親和力結合到CXCL8。CXCR1/2的C末端調節受體的磷酸化、內化、G蛋白偶聯以及與其他細胞質蛋白的結合，2個CXCL8高親和力受體的細胞信號傳導是非常復雜的[9]。有證據表明，CXCR1是啟動磷脂酶D活化的主要受體，CXCR2與細胞遷移相關[10]。CXCL8在肺部炎癥中起重要作用，有助于慢性阻塞性肺疾病的發展，有文獻表明，慢性阻塞性肺疾病患者痰和支氣管肺泡灌洗液中CXCL8的濃度高于健康志愿者，并且與中性粒細胞的積累相關[11]。中性粒細胞是先天免疫系統的重要組成部分，是第一組遷移到感染部位的細胞。在抵御微生物感染和啟動組織修復中趨化因子通過及時、協調地招募中性粒細胞發揮關鍵作用[12-13]。CXCL8-CXCR1/2軸在感染部位使中性粒細胞聚集，并誘導中性粒細胞氧化和顆粒釋放，以消除炎癥刺激并增加細菌清除率。因此，該軸保護宿主免受進一步感染和組織損傷，CXCL8- CXCR1/2軸的中斷可能嚴重影響宿主對感染的免疫機制[14]，甚至導致死亡。

由于CXCL8是炎癥介導過程的關鍵組成部分，CXCL8及其受體的異常調節與許多炎癥介導的疾病有關，CXCL8最有可能是將中性粒細胞帶到結核病患者感染部位的原因，CXCL8是宿主抗結核防御所必需的。CXCL8與受體CXCR1/2特異性結合后，可誘導大量炎癥細胞遷移至特定感染部位，產生局部炎癥免疫應答，通過與之偶聯的G蛋白變構激活下游的效應分子進行信號轉導[15]。結核分枝桿菌感染宿主后引起機體的局部炎癥反應，趨化因子及受體同時參與炎癥應答的激活。有研究表明，結核患者血漿趨化因子及其相應受體的表達水平顯著高于非結核患者[16]，推測趨化因子可以遷移到結核感染部位，誘導有效的Th1細胞免疫反應，有利于清除結核分枝桿菌。

對于CXCL8、CXCR1和CXCR2臨床意義的探索中，發現趨化性細胞因子CXCL8和受體CXCR1及CXCR2在結核患者保護性免疫中發揮重要作用。本研究通過RT-PCR法檢測初治肺結核患者、潛伏性感染者及健康對照組CXCL8、CXCR1和CXCR2的mRNA表達水平，研究結果發現，肺結核組外周血CXCL8、CXCR1和CXCR2的mRNA表達水平均顯著高于潛伏感染組和正常對照組(P<0.05)，提示在活動性肺結核患者中CXCL8、CXCR1和CXCR2表達升高，但是潛伏性感染組和對照組的結果差異無統計學意義。CXCL8及受體表達的變化與疾病的進展有關，并影響宿主對于結核分枝桿菌的免疫應答，根據不同臨床表型進行分組，結果顯示，肺部有空洞結核患者CXCL8、CXCR1和CXCR2的mRNA水平均顯著高于無空洞患者。活動性肺結核患者接受標準抗結核治療，且患者抗結核治療效果良好。隨訪6個月發現，治療3個月時CXCL8、CXCR1和CXCR2的mRNA水平表達明顯低于治療前，且隨著治療時間延長，CXCL8、CXCR1和CXCR2的mRNA表達量逐漸降低。

進一步應用ROC曲線分析CXCL8、CXCR1和CXCR2的診斷效能以及鑒別肺結核患者的敏感度和特異度。結果顯示，CXCL8、CXCR1和CXCR2均具有較高的敏感度和特異度。提示CXCL8、CXCR1和CXCR2對活動性肺結核診斷有一定的優勢，對病情的評估有指導作用，可能是區別活動性和潛伏性結核感染的敏感指標。

綜上所述，分析肺結核患者外周血趨化因子CXCL8和受體CXCR1、CXCR2的表達變化，在抗結核感染信號通路過程中的作用與聯系，可作為輔助診斷肺結核病的主要依據之一，有望成為診斷活動性肺結核病的重要標志物，更加深入地了解結核分枝桿菌的致病機制，為今后結核病的早期治療及改善結核病結局，發揮重要的臨床應用價值。