右美托咪定對體外循環手術患兒外周血中性粒細胞凋亡和NF-κB活性的影響

郭瓊梅，劉秀葉，王 莉，周曉輝，魏硯硯，毛瑞芬

(河北醫科大學第一醫院麻醉科，河北 石家莊 050031)

心臟直視手術中體外循環(cardiopulmonary bypass,CPB)的建立導致機體發生應激和炎癥反應，產生的炎性因子不僅加重心肌細胞的損傷[1]，還造成了除心臟外其他組織細胞的損傷，如術后的肺功能減退等[2]。中性粒細胞在炎癥反應中發揮重要作用，作為機體防御性反應的重要標志物被大量激活，引起呼吸爆發和全身炎癥反應綜合征。中性粒細胞的凋亡與清除是限制炎癥反應、炎癥消散的重要方式，抑制其凋亡可以加重、發展炎癥反應。研究證實，體外循環過程中外周血中性粒細胞數量增多，凋亡延遲和減少，導致血漿促炎癥因子水平升高，其嚴重程度與體外循環時間及主動脈阻斷時間相關[3]。中性粒細胞的蛋白表型與嬰幼兒體外循環后炎癥反應結果相關[4]。核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)的激活在炎癥級聯反應中發揮關鍵作用，抑制心肌NF-κB信號通路的激活可以減輕法洛四聯癥患兒體外循環后的全身炎癥反應[5]，不同劑量的右美托咪定可以減輕體外循環心內手術患兒的全身炎癥反應[6]。右美托咪定減輕體外循環患兒圍術期炎癥反應的作用是否與抑制中性粒細胞NF-κB活性、減輕中性粒細胞的凋亡抑制和延遲有關尚不清楚。本研究擬評價右美托咪定對體外循環心內直視手術患兒外周血中性粒細胞凋亡和NF-κB活性的影響，進一步探討右美托咪定減輕炎癥反應的機制。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2015年10月—2018年3月在河北醫科大學第一醫院擇期CPB下行室間隔缺損修補術患兒60例，美國麻醉醫師協會(American Society of Anesthesiologists，ASA)分級Ⅱ或Ⅲ級。無近期急性感染史，肝腎功能未見異常，無重度貧血及近期使用皮質激素治療史。采用隨機數字表法，將其分為2組(n=30)：對照組(C組)和右美托咪定組(D組)。2組患兒性別、年齡、體重、主動脈阻斷時間和連續性血液凈化時間比較差異均無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。見表1。

表1 2組一般情況各指標的比較Table 1 Comparison of general data between two groups

本研究經河北醫科大學第一醫院醫學倫理委員會批準；患兒監護人均知情同意并簽署知情同意書。

1.2麻醉方法 入室前30 min肌肉注射東莨菪堿0.01 mg/kg。肌肉注射氯胺酮4～6 mg/kg后入室，監測血壓、心率和血氧飽和度，開放外周靜脈通路，行橈動脈穿刺置管，持續監測MAP。麻醉誘導：靜脈注射咪唑安定0.15 mg/kg，舒芬太尼1 μg/kg，依托咪酯0.3 mg/kg，羅庫溴銨0.6 mg/kg誘導，氣管插管后行機械通氣，氧流量2 L/min，潮氣量10～12 mL/kg，吸呼比1∶2，維持PETCO235～45 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)。行右頸內靜脈穿刺置管。麻醉維持：間斷靜脈注射舒芬太尼0.5～1 μg/kg、羅庫溴銨0.3～0.6 mg/kg，丙泊酚4～6 mg·kg-1·min-1持續輸注。CPB采用WEL-1000人工心肺機(天津匯康醫用設備有限公司)和ODMO-100型膜式氧合器(西安岱岱生物醫學工程有限責任公司)。羥乙基淀粉130/0.4、壓積紅細胞、冷凍血漿等預充，晶膠比0.4～0.6∶1。動脈流量80～120 mL·kg-1·min-1，術中維持平均動脈壓 40～60 mmHg。術畢帶氣管導管入ICU，待患兒蘇醒、肌力恢復、血流動力學穩定后拔除氣管導管，術后進行靜脈鎮痛，配方為舒芬太尼2 μg/kg加生理鹽水稀釋至100 mL，輸注速率2 mL/h，維持VAS評分≤3分。

1.3標本采集及指標檢測 麻醉誘導后D組給予初始劑量0.5 μg/kg的鹽酸右美托咪定注射液(批號：20131101，江蘇恩華藥業股份有限公司)(給藥時間>10 min)，繼之以0.4 μg·kg-1·h-1的速率維持至術畢，C組給予等容量生理鹽水。于CPB開始前(T0)、CPB開始后30 min(T1)、CPB停止后30 min(T2)、CPB停止后4 h(T3)和CPB停止后24 h(T4)采集橈動脈血5 mL，其中3 mL肝素抗凝后，3 000 r/min離心10 min，取上層血漿，-20 ℃保存。采用Percoll密度梯度離心法分離中性粒細胞，瑞氏染色檢驗分離細胞的純度，臺盼蘭檢驗細胞活性。用流式細胞儀觀測中性粒細胞凋亡率和Caspase-3的表達。采用細胞核蛋白/漿蛋白抽提試劑盒(北京博凌科為生物科技有限公司)提取中性粒細胞核蛋白，BCA法進行蛋白定量。夾心酶聯免疫吸附測試法(Sandwich ELISA)測定NF-κB活性，酶標儀測定450 nm處的吸光值，反映NF-κB的活性。

1.4統計學方法 應用SPSS 13.0統計軟件分析數據。計量資料分別采用獨立樣本的t檢驗和重復測量的方差分析，兩變量間的相互關系用直線相關分析，計數資料比較采用χ2檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2組患兒中性粒細胞NF-κB活性在T1～4均較T0時升高(P<0.05)，D組在T1～4各時間點均低于C組，2組在組間、時點間及組間·時點間交互作用差異均有統計學意義(P<0.05)；2組患兒中性粒細胞凋亡率和Caspase-3的表達從T0到T2逐漸降低，T3、T4時升高，但均較T0時降低，D組在T1～4各時間點均高于C組，2組在組間、時點間差異均有統計學意義(P<0.05)。中性粒細胞凋亡率與NF-κB活性呈負相關(C組：r=-0.606，P<0.05；D組：r=-0.691，P<0.05)。見表2。

表2 2組中性粒細胞凋亡率、NF-κB活性和Caspase-3表達的比較Table 2 Comparison of apoptosis rate of polymorphonuclear,NF-κB activity and express of caspase-3 between two groups

3 討 論

中性粒細胞的大量激活是各種原因導致全身炎癥反應和嚴重的炎癥性疾病進展過程的重要環節。中性粒細胞被激活后可釋放蛋白水解酶和大量的氧自由基及各種炎癥介質，造成正常組織細胞的損傷。作為終末分化細胞的中性粒細胞凋亡被抑制時，各種炎癥介質和毒性物質釋放增多，導致炎癥反應加劇[7-9]。體外循環過程中的各種應激因素導致中性粒細胞被大量激活，引起的全身炎癥反應與中性粒細胞凋亡延遲相關。本研究結果也顯示，隨著CPB的進行，中性粒細胞凋亡率降低，在CPB停止后的30 min達最低。

NF-κB是一個重要的轉錄調節因子，是細胞凋亡過程中重要的調節因素。NF-κB的活化是中性粒細胞凋亡抑制的重要機制之一，在各種急性炎癥反應過程中發揮重要的調節作用。一些感染性疾病中NF-κB的活化導致中性粒細胞凋亡延遲，造成擴散機體組織功能的損傷[10]。NF-κB活化抑制中性粒細胞凋亡的機制包括NF-κB活化促進IL-8、IL-1β和TNF-α等炎性因子的釋放及上調抗凋亡蛋白Bcl-2、Mcl-1的表達，通過調節線粒體途徑抑制中性粒細胞的凋亡，調節細胞表面死亡受體的表達，抑制Caspase級聯反應等，從而抑制中性粒細胞的凋亡[9,11-12]。采用間充質干細胞治療或其他藥物抑制NF-κB活化，改善炎癥反應中性粒細胞凋亡被抑制的狀態，減輕脂多糖和內毒素所致的急性肺損傷[13-14]。本研究結果顯示，隨著CPB的進行，2組患兒NF-κB活性升高，中性粒細胞凋亡率降低，Caspase-3的表達降低，在CPB停止后30min時達最低值，且中性粒細胞凋亡率與NF-κB活性呈負相關，說明在體外循環過程中外周血中性粒細胞NF-κB的活化可能與中性粒細胞的凋亡減少和延遲有關。

右美托咪定作為全身麻醉的輔助用藥，有利于術中血流動力學的平穩，并通過抑制圍術期應激反應和血漿炎癥因子的釋放，減輕體外循環手術過程中及術后的全身炎癥反應及缺血再灌注損傷，保護心臟及其他重要臟器的功能[15-16]，研究表明這些作用的機制可能與抑制外周血單核細胞NF-κB信號通路的激活有關[17-18]。右美托咪定通過激活α2腎上腺素能受體抑制中性粒細胞趨化因子的產生及白細胞與內皮細胞的黏附作用[19]，減少中性粒細胞在組織器官的集聚，減少TNF-α和IL-6等炎癥因子的產生，減輕炎癥反應，在圍術期發揮器官保護作用[20]。右美托咪定可以減少大腸桿菌刺激產生的中性粒細胞呼吸爆發作用，這對減輕應激狀態下的全身炎癥反應綜合征具有積極意義。同時研究證實，右美托咪定在各種應激狀態下對不同臟器的保護功能與抑制NF-κB信號通路的作用有關[21-23]。本研究結果顯示，與對照組相比，右美托咪定組在CPB過程及停止后的各時間點中性粒細胞NF-κB活性降低，T2、T3時中性粒細胞細胞凋亡率明顯升高，Caspase-3的表達升高。Caspase-3是細胞凋亡死亡受體途徑和線粒體途徑信號轉導最終的共同通路，說明右美托咪定減輕了體外循環的中性粒細胞凋亡抑制，其可能與抑制NF-κB的活性有關。

綜上所述，NF-κB活性的抑制參與了右美托咪定減輕體外循環手術患兒外周血中性粒細胞凋亡抑制的過程，可能是其減輕體外循環手術患兒圍術期炎癥反應的作用機制之一。