去甲基姜黃素對腦梗死大鼠COX-2和iNOS水平的影響

葛龍敏， 李玥熠， 祝春華

(1.河北省石家莊市第三醫院保健科，河北 石家莊 050011；2.河北醫科大學基礎醫學院2016級臨床醫學一大班，河北 石家莊 050017；3.河北醫科大學第二醫院神經內科，河北 石家莊 050000)

從全世界范圍來看，卒中是目前導致成年人殘疾和死亡的最重要原因，給社會和家庭都帶來沉重負擔。我國缺血性卒中患者約占3/4以上，并且近年來發病率和病死率的增長速度明顯超過了世界平均水平[1]。盡管重組組織纖溶酶原激活劑(recombinant tissue plasminogen activator，rtPA)等靜脈溶栓藥物和血管內治療技術的推廣應用，已成為急性缺血性腦卒中重新開通血管的最有效方法，然而由于治療時間窗較短，僅約2%的患者從中獲益。盡管竭盡全力的挽救缺血腦組織，但仍然有超過50%的患者致殘甚至死亡[1]。近年來在腦梗死后的病理生理機制方面的研究已經取得了重大進展，但目前仍迫切需要探尋更有效的治療藥物，來改善腦梗死的預后。姜黃素(curcumin)是中藥姜黃的主要活性成分，是來源于姜科植物的一種小分子植物酸性多酚。研究發現，姜黃素具有抗炎、抗血栓形成、抗腫瘤、抗凋亡以及神經保護作用等[2]。一般所指的姜黃素是包括姜黃素、去甲基姜黃素(demethoxycurcumin，DMC)和雙去甲基姜黃素(bisdemethoxycurcumin，BDMC)三種化學成分的混合，其中姜黃素所占比例最大。但是，由于姜黃素在酸性或中性環境中水溶性差，在堿性溶液中又不穩定，使其口服制劑的生物利用度較低；此外，姜黃素具有體內清除迅速的特點，也是制約其藥物應用的主要原因[3-4]。越來越多的證據表明，DMC比姜黃素具有更好的抗腫瘤和抗炎效果，并具有更強的療效和更好的生物穩定性，成為一種具有吸引力和前景的姜黃素替代品[5]。前期研究結果顯示[6]，DMC通過降低血管內皮細胞環氧合酶2(cyclooxygenase-2,COX-2)水平，改善自發性高血壓大鼠(spontaneous hypertensive rats,SHR)的內皮功能。COX-2不僅介導高血壓導致的血管內皮損害，還是參與組織缺血后炎癥反應的重要分子。而DMC是否也通過抑制COX-2對腦梗死有保護作用，目前未見詳細報道。因此，本研究采用SHR構建大腦中動脈閉塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型，觀察DMC對COX-2和iNOS的調控作用，探討DMC對腦梗死的保護作用。

1 材料與方法

1.1實驗材料 DMC(購于成都曼斯特制藥有限公司)，分子式C20H18O5，純度大于98%；二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)(美國Sigma-Aldrich公司)；兔抗大鼠COX-2多克隆抗體(美國Abcam公司)；兔抗大鼠iNOS多克隆抗體(美國Abcam公司)；鼠抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)多克隆抗體(美國Ambion公司)；PVDF膜(美國Millipore公司)；Synergy-HT多功能酶標儀(美國Bio-Tek)；5417R冷凍高速離心機(德國Eppendorf公司)；線栓(2432-A，北京沙東生物技術有限公司)，線體總長4.0 cm，直徑0.24 mm，末端呈球形直徑為(0.32 ± 0.02) mm。

1.2實驗動物和分組 雄性30周齡的SHR由東南大學實驗動物服務中心提供，飼養環境為室溫22～24 ℃，光照/黑暗周期為12 h，自由攝取標準飲食和水。將SHR隨機分為對照組和DMC組。參照前期觀察DMC改善SHR血管內皮功能的動物實驗數據[6]，DMC組大鼠給予腹腔注射DMC(10 mg/kg)+DMSO，1次/d，持續3周；對照組給予溶劑對照，即腹腔注射同等體積的DMSO，1次/d，持續3周。

1.3構建SHR腦梗死模型 參照Longa等[7]的線栓法制作右側MCAO動物模型。水合氯醛(35 mg/kg)腹腔注射麻醉，腹部朝上固定大鼠。頸部去毛后消毒，于正中部位切口約3.0 cm，沿胸鎖乳突肌內緣逐層鈍性分離肌肉和筋膜至頸總動脈(common carotid artery，CCA)，并沿CCA向上分離血管以及與血管伴行的神經，謹慎剝離頸外動脈(external carotid artery，ECA)以及頸內動脈(internal carotid artery，ICA)，再沿ECA向顱底方向剝離，結扎ECA發出的分支翼腭動脈，使用動脈夾暫時夾閉ICA和CCA，在ECA上剪一切口，由此口處插入線栓并進入ICA的顱內段，松開ICA動脈夾，線栓進入深度為距離CCA分叉處約18 mm，結扎固定，消毒后縫合皮膚。手術中及術畢維持SHR肛溫在37 ℃左右，直至其恢復自主活動。全部SHR完成手術后，均在20～25 ℃恒溫、潔凈條件下飼養，自由進食水。評價MCAO模型成功的標準為同時具備以下體征：①疼痛刺激時左側肢體回縮遲鈍或消失；②抓尾懸空時，SHR左前肢向胸前屈曲；③自主行走時大鼠身體向右側傾，或向右轉圈不能走直線；④右側眼部出現 Honer's癥。

1.4神經功能評價 術后24 h時，采用單盲法、改良的Longa分級法[7]，評價各組大鼠MCAO術后肢體神經功能缺失情況：無肢體功能異常為0分；左側前肢不能伸展為1分；左側前肢屈曲為2分；身體輕度向左側轉圈為3分；身體嚴重向左側轉圈為4分；整個身體向左側傾倒為5分。

1.5測量腦梗死體積 MCAO術后24 h時，將各組大鼠斷頭并剝取腦，去除小腦和腦干，在腦切片模具上均勻、冠狀將大腦切成5片，厚度約3 mm，全部浸入2%的2,3,5-氯化三苯基四氮唑(2,3,5-triphenyltetrazolium chloride，TTC)溶液中染色，放置37 ℃恒溫環境30 min后，在4 %多聚甲醛液體中固定24 h。紅色區域為正常腦組織，蒼白色區域為腦梗死病灶。腦片逐個拍照，利用圖像分析軟件 Image J(ver1.37c,NIH)測定腦梗死面積，并采用公式=(矯正右側腦梗死體積/左側大腦半球體積)×100%計算腦梗死體積的百分比數值。

1.6Western blot方法 檢測COX-2、iNOS蛋白水平 MCAO術后24 h時，各組SHR取腦梗死核心周圍的皮層腦組織，采用Lowry法(Bio-Rad Laboratories,Hercules,CA,USA)測定蛋白濃度。等數量的蛋白質樣品在10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠上電泳約100 min，在4 ℃條件下轉移、固定到PVDF膜上。用5%脫脂牛奶室溫非特異性封閉1 h后，加入兔抗大鼠COX-2(1∶500封閉液稀釋)、兔抗大鼠iNOS多克隆抗體(1∶500封閉液稀釋)，鼠抗GAPDH多克隆抗體(1∶400，封閉液稀釋)，4 ℃孵育過夜。后將膜在PBST中洗滌3次，然后與羊抗兔IgG熒光抗體抗體(1∶3 000，封閉液稀釋)在室溫下孵育1 h。最后一次洗膜后，酶標儀上掃描，并測定目標抗體條帶的單位密度。以GAPDH作為內參。

1.7統計學方法 應用SPSS 13.0統計軟件處理數據。計量資料比較采用獨立樣本t檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1DMC減輕MCAO術后的神經功能損害 在術后24 h時，對照組和DMC組Longa評分均較高，與對照組比較，DMC組的Longa評分顯著降低，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 DMC減輕MCAO術后神經功能損害 分)

2.2DMC顯著減小MCAO術后腦梗死體積 對照組和DMC組均可見不同大小的腦梗死病灶。與對照組比較，DMC組腦梗死病灶體積明顯減小(P<0.05)。見圖1和表2。

圖1 DMC減小MCAO后腦梗死體積

表2 DMC減小MCAO后腦梗死體積

2.3DMC抑制MCAO術后COX-2、iNOS的表達水平 Western blot的結果顯示,MCAO術后24 h時，與對照組比較，DMC組COX-2、iNOS蛋白表達水平被顯著抑制，差異有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 DMC抑制MCAO術后COX-2、iNOS蛋白表達水平

3 討 論

高血壓是腦卒中最重要的危險因素，與腦卒中之間存在強烈的、連續的、一致的、獨立的相關性[8]。在我國，因腦卒中所致的社會和經濟負擔中有73%與高血壓有關[9]。前期研究結果顯示，DMC抑制COX-2水平，改善了SHR腎動脈的血管內皮功能，并有直接降低SHR血壓的作用[10]。在此基礎上，本研究進一步觀察了DMC對SHR腦梗死的作用。選擇SHR構建MCAO模型，與普通大鼠比較，能夠更好地模擬腦梗死的發生、發展過程，更符合目前腦梗死臨床背景。本研究結果顯示，DMC預處理能夠顯著改善SHR腦梗死后肢體的神經功能，并減小了腦梗死體積，抑制COX-2和iNOS表達水平。與Ramkumar等[11]發現DMC抑制COX-2、iNOS等炎癥因子，對帕金森病大鼠模型具有抗炎、抗氧化等神經保護作用的結果類似。有研究發現，在帕金森治療過程中，DMC是最有效的抑制左旋多巴代謝酶的藥物之一[12]。此外，Hatamipour 等[10]對于DMC的廣泛作用進行的系統綜述中，詳細總結了DMC具有抗炎、神經保護、抗高血壓、抗菌和血管舒張等作用，并且根據DMC抗炎和神經保護作用機制方面的研究顯示，COX-2、iNOS是重要的參與分子。

環氧合酶(cyclooxygenases,COX)是花生四烯酸轉化為前列腺素的關鍵酶，COX家族包括COX-1和COX-2兩種亞型。COX-2不僅介導血管內皮的炎癥反應，產生活性氧(reactive oxygen species，ROS)導致內皮細胞功能紊亂和血管收縮，而且也是腦梗死后炎癥性腦損傷過程的重要參與者[6]。腦梗死后COX-2的表達水平于12～24 h時達到高峰，主要分布于腦梗死病灶周圍的神經元和血管內皮細胞。而且，在腦梗死模型中選擇性抑制COX-2水平可以減少20%～30%的腦梗死體積，并有效減少神經元損傷，且與抑制谷氨酸神經毒性以及繼發的炎癥反應有關[13]。因此認為，COX-2參與了腦梗死早期的損傷過程，可能是治療腦梗死的一個有價值的治療靶點。DMC是傳統中藥的有效成分，具有抗炎、抗腫瘤、抗凋亡等多效性。本研究中，DMC抑制COX-2水平，減輕了腦梗死后炎癥反應，具有腦保護作用。

一氧化氮(nitric oxide,NO)是廣泛分布于各種組織，特別是神經系統的生物信號分子。研究表明，腦梗死早期NO即反應性顯著升高，NO可以刺激線粒體產生超氧化物和二氧化氫，通過細胞凋亡機制以及抑制呼吸和糖酵解過程而加速細胞死亡。一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)是催化NO合成的關鍵酶，包括nNOS、eNOS和iNOS三種亞型。其中，nNOS主要定位于正常神經元，eNOS主要存在于內皮細胞和一些神經元中。與前兩者不同，iNOS只是在炎癥狀態下誘導表達，在中樞神經系統主要分布于膠質細胞。在腦梗死時iNOS被迅速誘導并產生大量NO，兩者共同參與炎癥反應過程。有大量研究證明，抑制iNOS表達水平能夠明顯抑制炎癥反應和氧化應激，從而減小腦梗死體積、減輕缺血性腦損傷[14]。

COX-2和iNOS不僅僅是兩個參與炎癥反應的重要分子，在炎癥反應過程中兩者之間還有緊密關聯。在體外研究中發現，COX-2抑制劑對心肌細胞缺氧時的保護作用與抑制iNOS表達增強有關[15]。與Romana-Souza等[16]在壓瘡小鼠皮膚創面愈合的研究結果相似，COX-2選擇性抑制塞來昔布通過降低iNOS和COX-2的表達，改善壓瘡創面愈合，減輕創面炎癥，促進真皮重建和瘢痕形成。由此可見，在參與不同組織、不同環境的炎癥反應過程中，COX-2對iNOS可能有一定調控作用，詳細機制仍需深入研究。

在本研究中，DMC抑制了MCAO誘導的COX-2和iNOS表達，抑制炎癥反應，減輕缺血性腦損傷。在前期研究證明DMC有效抑制血管內皮炎癥、改善SHR腎動脈血管功能的研究基礎之上[6]，進一步證明了DMC預處理對腦梗死具有保護作用。但對腦梗死后干預治療是否具體同等的效果以及詳細機制仍需進一步探討。