補腎活血祛瘀法對早期閉合性骨折模型大鼠愈合程度及血管新生的影響及作用機制

王飛，付霆

(湖北省武漢市第一醫院，湖北 武漢 430022)

閉合性骨折是指骨折處不與外界相通，黏膜或皮膚完整的骨折。骨折愈合是指骨折斷端間的組織修復反應，是恢復骨的正常結構和正常功能的愈合反應[1-2]。中醫認為骨折愈合是“瘀祛、新生、骨合”的過程，血瘀始終貫穿于骨折的整個過程，而腎虛血瘀為主要臨床證型，治療易補腎活血祛瘀[3]。中醫藥在其治療歷史悠久，療效良好，具有顯著優勢。中醫對骨折治療以活血化瘀藥為主[4]。補腎活血祛瘀法方為我院內制劑，具有補腎活血去瘀、消腫止痛之功效，用于骨折、脫臼與軟組織扭挫傷，在我院取得良好的臨床療效。本研究通過建立閉合性骨折模型，探討補腎活血祛瘀法對早期閉合性骨折大鼠愈合程度及血管新生的影響及作用機制，旨在為臨床提供治療參考。

1 資料與方法

1.1 動物

SPF級健康SD大鼠，體質量(200±10)g，雌雄各半，由上海耀源生物科技有限公司提供，動物合格證號：SYXK(滬)2019-0024。

1.2 藥品與試劑

3%戊巴比妥鈉(國藥集團化學試劑有限公司)；蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)；血管內皮細胞生長因子(武漢博士德生物技術有限公司)；血栓素B2(TXB2)和6-酮前列腺素F1(F1 6-Keto-PGF1)ELISA試劑盒(解放軍總醫院科技開發中心放免所)；麝香接骨膠囊(吉林龍泰制藥股份有限公司，批號：190123)；補腎活血祛瘀方為本院協定處方，其組成為：淫羊藿30 g，熟地黃20 g，川續斷、紅花、當歸尾、白芍、丹參各15 g，骨碎補10 g，三七9 g，甘草6 g。藥材均為本院中藥房提供，加8倍量水煎煮2次，濾過，濃縮成0.25 g/mL的煎煮液，放涼后待用。

1.3 實驗儀器

SA-5600型全自動血流變儀(上海三崴醫療設備有限公司)；HD-310A/HD-310B 自動包埋機(湖北慧達儀器有限公司)；TD5A-WS/TD5AWS型低速離心機(湖南湘儀離心機有限公司)；DG-3022型酶聯免疫檢測儀(日本OLYMPUS公司)；BXS05-SN-6105型放射免疫計數器(北京北信科儀分析儀有限公司)；超低溫冰箱(冠森生物科技(上海)有限公司)。

1.4 造模與分組

按照體質重隨機分為對照組、模型組、陽性組、試驗組，每組15只。對照組未經任何處理，其余各組參考文獻[5]制定閉合性骨折模型，即3%戊巴比妥鈉腔注射麻醉大鼠，局部脫去大鼠腿毛，三點受力原理，借專用的骨折器模擬長骨干骨折時的受力造成脛骨閉合性骨折模型，不予固定，縫合傷口。骨折后的大鼠放置籠中自由活動和進食。建模成功后，陽性組給予麝香接骨膠囊0.5 g/kg灌胃；試驗組給予補腎活血祛瘀法方灌胃，劑量2.5 g/kg，連續6周。

1.5 觀察指標

1.5.1 骨折處組織病理以及骨痂微血管測定

4周后處死大鼠，取骨折處上下各0.5 cm骨標本，10%甲醛固定7 d， Jenkins混合脫鈣液脫鈣，乙醇脫水，置于已熔化的石蠟中進行包埋，切厚5 μm切片放于載玻片上， 45 ℃恒溫箱中烘干，脫蠟染色。10×10倍光鏡下鏡檢，并隨機抽取5個視野計算毛細血管數，求均值，單位%。

1.5.2 骨折區組織質量

處死大鼠后，取3份骨折組織進行稱量，取平均值。

1.5.3 血清骨鈣素、Ⅰ型膠原以及血清VEGF檢測

取腹主動脈血3 mL， 4 ℃下，離心(3 000 r/min)5 min，取上清液，于-20 ℃保存備用。采用酶聯免疫吸附實驗(ELISA)檢測血清骨鈣素、Ⅰ型膠原和血清VEGF含量，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.5.4 血漿TXB2、6-Keto-PGF1的檢測

取3 mL腹主動脈血，加入到肝素鈉混勻，離心(4 ℃，3 000 r/min，15 min) 分離血漿，置-20 ℃冰箱保存，采用ELISA 法檢測TXB2、6-Keto-PGF1 ，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.5.5 血液黏度檢測

腹主動脈取血5 mL加入到肝素鈉混勻，采用SA-5600型全自動血流變儀檢測大鼠全血黏度和血漿黏度。

1.6 統計學處理

2 結果

2.1 骨折愈合和血管新生情況

與對照組比較，模型組大鼠的骨折面缺損明顯形成，即造模成功。給予藥物干預后，陽性組和試驗組大鼠缺損毛細血管以及靜脈新生，且已有大量成骨細胞的形成，而試驗組大鼠的骨折面中的骨小梁和骨性骨痂的形成明顯。見圖1。

圖1 各組大鼠閉合性骨折愈合程度及骨痂微血管新生情況的影響(HE，×400)

2.2 Ⅰ型膠原含量、骨鈣素含量以及骨折區組織質量情況比較

14 d后，模型組大鼠的Ⅰ型膠原含量和骨鈣素含量水平明顯高于對照組(P<0.05)。給予藥物治療后，陽性組和試驗組Ⅰ型膠原含量、骨鈣素含量以及骨折區組織質量明顯低于模型組(P<0.05)，兩組間的血清Ⅰ型膠原含量、骨鈣素含量比較具有顯著性差異(P<0.05)，兩組間的骨折區組織質量比較無顯著性差異(P>0.05)，見表1。

2.3 TXB2、6-Keto-PGF1α水平以及TXB2/6-Keto-PGF1α比較

14 d后，模型組的血清TXB2水平和TXB2/6-Keto-PGF1α水平明顯高于對照組，血清6-Keto-PGF1α水平明顯低于對照組(P<0.05)。給予藥物治療后，陽性組和試驗組TXB2和TXB2/6-Keto-PGF1α明顯低于模型組，血清6-Keto-PGF1α水平明顯低于對照組(P<0.05)，兩組間的血清TXB2、6-Keto-PGF1α水平以及TXB2/6-Keto-PGF1α具有顯著性差異(P<0.05)，見表2。

表1 各組大鼠的Ⅰ型膠原含量、骨鈣素以及骨折區組織質量情況比較

表2 各組大鼠TXB2、6-Keto-PGF1α和TXB2/6-Keto-PGF1α比較

2.4 血液黏度比較

14 d后，模型組的全血黏度和血漿黏度明顯高于對照組(P<0.05)。給予藥物治療后，陽性組和試驗組全血黏度和血漿黏度明顯低于模型組(P<0.05)，兩組間的全血黏度和血漿黏度比較具有顯著性差異(P<0.05)，見表3。

表3 兩組血液黏度指標比較

2.5 血清VEGF和骨痂微血管數比較

14 d后，模型組的血清VEGF水平明顯高于對照組(P<0.05)。給予藥物治療后，陽性組和試驗組VEGF水平明顯低于模型組，骨痂微血管數明顯低于模型組(P<0.05)，兩組間的血清VEGF和骨痂微血管數比較具有顯著性差異(P<0.05)，見表4。

表4 各組大鼠的血清VEGF和骨痂微血管數比較

3 討論

骨折是骨的完整性和連續性中斷，可引起骨折部位局部變形、腫脹、移動劇痛以及瘀血等情況，可限制患者運動，嚴重影響其日常生活。血清骨鈣素在調控軟骨礦化發揮重要作用，Ⅰ型膠原表達的增加可誘導成骨細胞增殖分化，有利骨折組織修復[6]。血小板聚集的分子調節機制主要為TXA2和PGI2，TXA2通過抑制腺苷酸環化酶或促進Ca2 +內流促使血小板聚集和局部血管收縮，加速血栓形成。PGI2做為最強血管擴張劑和血小板抑制劑，通過抑制血小板的聚集和協同擴張血管，進而降低血液黏稠度，促進消除瘀血。TXB2為TXA2的代謝產物，6- Keto- PGF1α是PGI2的代謝產物，可間接血小板聚集水平，了解血液凝集狀態[7-8]。VEGF為促血管形成因子，不僅能夠刺激內皮細胞增殖，促進血管重建，還能夠增強軟骨細胞活性，其他促血管生成因子的血管重建作用的實現均與VEGF有關[9]。

中醫認為骨折后血瘀積于經脈不散，致使經脈受阻，影響骨折愈合的速度；肝腎與骨生長具有密切的相關性，中醫認為，肝主筋，腎主骨生髓，因此，調節肝腎可以增加精血對骨折組織的濡養，治療應該補腎活血化瘀。補腎活血祛瘀法以補腎活血化瘀藥為主，其中淫羊藿、川續斷、骨碎為補腎藥物，熟地黃、紅花、當歸尾、白芍、丹參、三七、甘草為活血化瘀藥。相關研究已證實，在骨折治療過程中，加用補腎生髓藥可促使骨折愈合[10]。現代藥理學顯示[11-15]，丹參有效成分丹參酮IIA、丹參素、丹酚酸B和兒茶醛等，可促進骨形成、間充質干細胞向成骨細胞及軟骨細胞分化，促進骨折愈合、成骨細胞和軟骨細胞增殖，抑制破骨細胞和抗骨組織以及無機元素代謝紊亂的作用；當歸有效成分可直接作用于骨髓細胞，改善血細胞的生產環境，并有顯著的止血止痛作用；三七有效成分三七總皂苷有效地抑制骨折后血液高凝狀態，保護血管內皮，增加骨組織中b-FGF和VEGF的表達，進而促進骨折愈合；紅花有效成分紅花黃色素可降低血漿黏稠度，有效地抑制血小板聚集，降低血小板內游離鈣離子濃度，促進骨折患者圍術期炎性反應因子的清除。近年研究發現[16]，桃紅四物湯對脛骨閉合性骨折具有很好的祛瘀生新作用，其作用機制可能與改善血液黏度減低TXB2/6-Keto-PGE1α，促進VEGF的表達有關。

本研究結果顯示，與對照組比較，模型組大鼠的骨折面缺損明顯形成，即造模成功,Ⅰ型膠原含量、骨鈣素含量水平明顯高于對照組。給予藥物干預后，陽性組和試驗組大鼠缺損毛細血管以及靜脈新生，且已有大量成骨細胞的形成，Ⅰ型膠原含量、骨鈣素含量明顯低于模型組，而試驗組大鼠的骨折面中的骨小梁和骨性骨痂的形成明顯。提示補腎活血祛瘀法可促進早期閉合性骨折模型大鼠愈合。與對照組比較，模型組大鼠的血清TXB2水平、TXB2/6-Keto-PGF1α水平、全血黏度和血漿黏度明顯高于對照組，血清6-Keto-PGF1α水平明顯低于對照組(P<0.05)。藥物干預后，陽性組和試驗組大鼠缺損毛細血管以及靜脈新生，且TXB2和TXB2/6-Keto-PGF1α和血黏度、血漿黏度明顯低于模型組，血清6-Keto-PGF1α水平明顯低于對照組(P<0.05)，兩組間比較均有顯著性差異(P<0.05)。提示補腎活血祛瘀法可促使早期閉合性骨折模型大鼠降低血液黏度，促使血管新生。

綜上所述，補腎活血祛瘀法可提高早期閉合性骨折模型大鼠Ⅰ型膠原含量和骨鈣素含量，提高骨折愈合度，降低血液黏度，降低TXB2/6-Keto-PGE1α比值，促使血管新生。