生產禽流感病毒的懸浮MDCK細胞穩定性的研究

白春麗 葉倩 姬阿美 劉旭平，2張旭 劉志亮 朱明龍 趙亮

譚文松1，2（1. 華東理工大學生物反應器工程國家重點實驗室，上海 200237；2. 上海倍諳基生物科技有限公司，上海 201203；3. 山東信得動物疫苗有限公司，濰坊 262204）

犬腎上皮細胞（Madin-Darby canine kidney cells，MDCK）由于其對流感病毒敏感性高，成為流感疫苗生產的最佳宿主之一［1］。自1995年WHO呼吁采用哺乳動物細胞進行流感疫苗生產以來［2］，基于MDCK生產流感疫苗的研究不斷深入。但連續細胞系在體外長期培養過程中往往會因為操作者習慣或培養基營養成分等因素而累積一些選擇性壓力，改變細胞的某些特征屬性［3-4］。因此，為保證疫苗生產的穩定性和可重復性，不斷有學者對貼壁MDCK細胞傳代過程中的特性進行研究，包括細胞形態［5］、跨膜電阻［6］、細胞生長［7］、產毒情況［8-9］等，發現不同代次MDCK細胞之間存在不同程度的差異。

然而，貼壁細胞培養模式操作繁瑣且需要添加血清，而血清卻存在成本較高、批次間質量不穩定、不利于下游純化等問題。相比之下，不需要添加血清的無血清懸浮培養工藝則更具生產優勢，基于懸浮培養體系的疫苗生產工藝也逐漸成為主流。在近年就已有Novartis、Seqirus、SK Chemicals等公司憑借懸浮MDCK細胞所生產的流感疫苗被批準上市［10］。然而，目前對于流感疫苗生產所用的懸浮MDCK細胞傳代穩定性的研究卻極少。

此外，不同文獻報道的馴化MDCK細胞所用培養基也有所不同，馴化成功的懸浮MDCK細胞的生長與產毒能力等也均存在一定差異。Wang等［11］使用懸浮MDCK細胞所產H9N2病毒的產量有210，李自良等［12］的懸浮MDCK細胞所產H1N1病毒滴度可達26-7，吳培培等［13］馴化所得懸浮MDCK細胞生產H9亞型產量為29。而本研究所用懸浮MDCK細胞在特定生產條件下H9N2流感病毒產量最高可達214，是目前生產甲型流感病毒報道中產量最高的宿主細胞［14］。高產的懸浮MDCK細胞在生產中很受歡迎，但細胞的高產特性是否可以穩定維持，需要進一步進行探索。

為此，本研究以實驗室保存的一株高產MDCK懸浮細胞為研究對象，采用實驗室自主研發的無血清培養基對其進行長達200多天的傳代培養，考察不同培養代次細胞在生長和H9N2病毒生產能力方面的差異，并對產毒差異的原因進行探究，以表征懸浮MDCK細胞在長期傳代中細胞生長與生產的穩定性，旨為基于懸浮MDCK細胞進行流感疫苗生產的工藝穩定性奠定數據基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株與病毒株 MDCK懸浮細胞由購自美國菌種保藏中心的貼壁細胞（CCL-34）馴化所得。甲型流感病毒株A/chicken/Guangxi/SIC6/2013（H9N2）為肇慶大華農生物藥品有限公司惠贈，在MDCK懸浮細胞中傳代適應，收獲后的毒株作為本實驗種毒，其半數組織培養感染劑量（50% tissue culture infective dose，TCID50）為8.50 Log10TCID50/mL。

1.1.2 主要試劑與儀器 Driving-M SF002 MDCK無血清懸浮培養基為實驗室自主研發，用于懸浮MDCK細胞傳代培養以及病毒感染實驗。50 mL培養管購自瑞士TPP AG公司，125 mL搖瓶購自美國Corning公司。細胞周期與細胞凋亡檢測試劑盒、活性氧檢測試劑盒均購自碧云天，借助流式細胞儀（Beckman，USA）檢測。酶標儀購自北京普朗；自動細胞計數儀購自Invitrogen公司；離心機購自Beckman Coulter公司。

1.2 方法

1.2.1 懸浮MDCK細胞傳代培養 將處于指數生長期的懸浮MDCK細胞以1×106cells/mL左右的密度接種于50 mL的培養管中，裝液量20 mL，置于37℃、5% CO2、220 r/min培養箱中培養，每2 d傳代一次，即采用新鮮培養基將細胞液稀釋至1×106cells/mL。將該懸浮MDCK細胞進行長達200 d以上傳代培養，并凍存不同代次細胞（P1、P29、P63、P88、P111）以便于后續細胞生長以及病毒生產能力差異分析。

1.2.2 細胞傳代穩定性差異分析 同時復蘇1.2.1中各代次細胞，待細胞生長穩定后，進行為期14 d的傳代培養，實驗方法同1.2.1，對比分析傳代過程中各代次細胞的細胞形態、比生長速率以及細胞直徑等差異。

1.2.3 批培養過程細胞穩定性研究 取處于指數生長期的P1、P29、P63、P88、P111這5個代次懸浮MDCK細胞，經1 000 r/min離心5 min后棄去上清，再用25 mL新鮮培養基重懸于50 mL培養管中，初始細胞密度為0.5×106cells/mL左右，置于37℃、5%CO2、220 r/min培養箱中進行為期9 d的批培養。

1.2.4 各代次細胞流感病毒生產能力變化 分別取P1、P29、P88、P111懸浮MDCK細胞進行實驗。在活細胞密度達到（10-12）×106cells/mL時，按新鮮培養基與細胞液體積比為1∶1稀釋細胞液，接種于125 mL搖瓶，裝液量30 mL，感染復數（Multiplicity of infection，MOI）為0.01，TPCK-胰酶添加濃度為5 μg/mL，置于37℃、5% CO2培養箱中培養，搖床轉速為130 r/min。

1.2.5 培養基稀釋比例對高低代次懸浮MDCK細胞產毒差異的影響 P1、P111細胞生長至（10-12）×106cells/mL時，在125 mL搖瓶中使用新鮮培養基對細胞液進行稀釋，工作體積為30 mL，其新鮮培養基所占比例分為100%（全離心換液），67%，50%和33%，MOI為0.01，TPCK-胰 酶 添 加 濃 度 為5 μg/mL，置于37℃、5% CO2培養箱中培養，搖床轉速為130 r/min。

1.2.6 MOI對高低代次懸浮MDCK細胞產毒差異的影響 取細胞密度為（10-12）×106cells/mL的P1、P111細胞懸液，經1 000 r/min離心5 min后棄去上清，使用新鮮培養基重懸，以（5.5-6）×106cells/mL活細胞密度接種于125 mL搖瓶，裝液量30 mL。在感染復數（Multiplicity of infection，MOI）為1、0.1、0.01、0.001，TPCK-胰酶添加濃度為5 μg/mL條件下研究P1、P111產毒能力差異。搖瓶置于37℃、5% CO2培養箱中，搖床轉速為130 r/min。

1.2.7 同步病毒感染過程中ROS差異分析 為探究高低代次懸浮MDCK細胞在病毒感染后胞內活性氧（Reactive oxygen species，ROS）的區別，以MOI為10進行病毒感染，在保證大量細胞同時被病毒感染的情況下進行胞內ROS水平檢測。具體操作如下：取細胞密度為（10-12）×106cells/mL的P1、P111細胞懸液，1 000 r/min、5 min離心后使用新鮮培養基重懸。初始細胞密度為6×106cells/mL左右，125 mL搖瓶中裝液量30 mL，MOI為10，TPCK-胰酶濃度為5 μg/mL，搖瓶置于37℃、5% CO2培養箱中孵育1 h，搖床轉速為130 r/min，后離心去上清，使用PBS洗滌去除多余的病毒以及TPCK-胰酶，后離心去上清，并再次使用新鮮培養基重懸，置于37℃培養箱中培養。取0 hpi、6 hpi的細胞液進行胞內ROS水平檢測，依據活性氧檢測試劑盒的操作方法進行操作。

1.2.8 流感病毒感染前細胞周期檢測 待P1、P111細胞生長至（10-12）×106cells/mL，依據細胞周期與細胞凋亡檢測試劑盒的操作方法，對P1、P111細胞的周期分布進行檢測。

1.2.9 病毒滴度檢測 使用雞紅細胞懸液（2×107cells/mL）進行血凝實驗測定總病毒顆粒濃度［15］，病毒滴度單位為Log2HAU/100 μL。單細胞產毒率（svy）的計算方法參考文獻［14］，其單位為virions/cell。

1.2.10 統計學分析 實驗結果采用t檢驗進行統計學分析，P<0.05表示實驗結果存在顯著性差異（*：P<0.05；**：P<0.01；***：P<0.001）。

2 結果

2.1 懸浮MDCK細胞生長穩定性研究

2.1.1 不同代次細胞形態差異 對各代次細胞進行傳代培養，其細胞形態如圖1所示。結果顯示，各代次細胞形態良好，表面光滑圓潤，均以大小均一的球形單細胞形式存在，無明顯結團。這表明，在實驗范圍內懸浮MDCK長期傳代培養中細胞形態維持不變。

2.1.2 不同代次細胞的傳代穩定性 為研究懸浮MDCK細胞長期傳代的穩定性，選擇P1、P29、P63、P88、P111細胞進行傳代實驗，考察各代次細胞傳代生長差異，結果見圖2。結果顯示，在多次傳代過程中，各代次細胞的細胞密度、細胞直徑均維持在穩定水平，比生長速率維持在（0.98-1.10）/d，各代次細胞之間無顯著性差異（P>0.05）。這些結果表明，該懸浮MDCK細胞在實驗范圍內傳代穩定性良好。

圖1 各代次懸浮MDCK細胞的形態

2.1.3 不同代次細胞的批培養穩定性 為考察各代次細胞在有限營養環境中的生長能力，將各代次細胞進行為期9 d批培養實驗，結果見圖3。結果顯示，在此過程中各代次細胞的活細胞密度、細胞活率、比生長速率變化趨勢相似，且均在第5天達到最高活細胞密度（VCDmax），并未出現隨細胞代次增加VCDmax增加或降低的趨勢，各代次細胞VCDmax平均值為（14.87±0.44）×106cells/mL。這表明，在實驗范圍內P1至P111懸浮MDCK細胞批培養生長能力相似，MDCK細胞批培養穩定性良好。

2.2 不同代次細胞流感病毒生產能力差異

將各代次細胞以培養基與細胞液體積比為1∶1的常規工藝稀釋接毒，考察長時間傳代后懸浮MDCK細胞產毒能力的變化情況。結果顯示（圖4），各代次細胞接種流感病毒后48 hpi內HA滴度不斷增加，隨后趨于穩定。對比P1、P111病毒產量，24 hpi與48 hpi兩代次存在顯著性差異（P<0.05），其 中P111最 高 滴 度（HAmax）為（13.02±0.18）Log2HAU/100 μL，較P1細胞（12.52±0.02）Log2HAU/100 μL提高了0.47 Log2HAU/100 μL，其他代次細胞（P29、P88）HAmax處于P1與P111兩代次細胞之間。為去除細胞密度的影響，進一步計算了單細胞產毒率（svy），結果顯示svy變化趨勢與HA滴度相似，在每個取樣點P111細胞svy均高于P1細胞。上述結果表明，在實驗傳代過程中，細胞的病毒生產能力呈提高趨勢。

圖2 各代次懸浮MDCK細胞傳代過程中活細胞密度（A），細胞直徑（B）以及比生長速率（C）變化

圖3 各代次懸浮MDCK細胞批培養過程中活細胞密度（A），細胞活率（B）以及比生長速率（C）變化

圖4 各代次懸浮MDCK細胞流感病毒HA滴度（A）與單細胞產毒率（B）隨時間變化

2.3 不同生產工藝下高低代次細胞產毒情況驗證

2.3.1 培養基稀釋比例對高低代次細胞產毒差異的影響 病毒生產階段與細胞生長階段的物質能量需求有所不同，有利的營養物濃度配比更能促進病毒復制，不同新鮮培養基與細胞液的體積比可以改變細胞的物質代謝方向，是病毒生產過程中經常需要考察的工藝條件。

為驗證不同代次細胞產毒差異情況是否受細胞液稀釋比例的影響，本實驗將P1、P111細胞作為研究對象，考察高低代次細胞在不同稀釋比例下的最高病毒產量（HAmax與svymax）。由圖5可見，新鮮培養基比例越高，HAmax與svymax越高，說明營養物質越充足越有利于此懸浮MDCK細胞的病毒生產。另外，對比P1、P111細胞產量發現，每個稀釋比例條件下，P111細胞HAmax與svymax均高于P1細胞，分別高約（0.57-1.09）Log2HAU/100 μL、（5.65-15.78）×103virions/cell。表明在此實驗條件中，相同稀釋比例條件下細胞代次越高越利于病毒生產。

圖5 不同稀釋比例下高低代次懸浮MDCK細胞所產流感病毒最高HA滴度（A）與最高單細胞產毒率（B）

2.3.2 不同MOI對高低代次細胞產毒差異的影響 MOI指病毒數與細胞數的比值，MOI對病毒的生產有極大的影響，不同細胞在特定產毒環境下最適MOI也有所不同。本研究通過設置不同MOI條件進行病毒感染以探究高低代次細胞的病毒生產情況。結果（圖6）發現，不同MOI條件下HA與svy均在48 hpi達到最高，對比各MOI條件下病毒生產情況發現，MOI越低，HAmax與svymax越高。對比P1、P111細胞產量發現，無論在何種MOI條件下，在每個取樣點P111細胞HA以及svy依舊普遍高于P1細胞。進一步確定在實驗MOI范圍內，懸浮MDCK細胞代次越高越利于病毒的生產。

2.4 細胞產毒差異作用機制初探

圖6 不同MOI下懸浮MDCK細胞生產流感病毒HA滴度與單細胞產毒率隨感染時間的變化

2.4.1 同步感染復制過程中高低代次細胞ROS水平差異 ROS為含氧的化學反應性物質，病毒感染會誘導宿主細胞生成ROS促進病毒RNP出核運輸等過程［16］，但ROS過高對細胞有毒害作用［17］。為探究ROS對高低代次產毒的影響，本實驗檢測了同步感染流感病毒條件下P1、P111胞內ROS變化情況，結果見圖7。在此條件下P111細胞的HA與svy依然高于P1細胞。以0 hpi的P1所測ROS含量作為對照，發現P111細胞的初始ROS水平低于P1細胞。病毒感染后，0-6 hpi內ROS含量呈現上升趨勢，6 hpi 時P1、P111細胞ROS含量分別上升至0 hpi的2.28、4.03倍，雖然P111細胞上升幅度較大，但6 hpi的 P111的ROS含量依然低于P1細胞。說明P111細胞在病毒感染初期始終維持較低水平ROS。

2.4.2 病毒感染前高低代次細胞周期分布 在上述2.3.2中發現24 hpi下P111細胞始終維持高產，為確定是否P111細胞在接毒前處于更利于病毒生產的細胞狀態，檢測了病毒感染前P1、P111的細胞周期分布情況。結果（表1）顯示，P111細胞具有較高比例G0/G1期的細胞群體，約高于P1細胞10%（P<0.01）。

3 討論

圖7 產毒期P1與P111的胞內ROS水平

表1 病毒感染前P1與P111的細胞周期分布

懸浮MDCK細胞憑借著對流感病毒的高敏感性且易于規模放大等優勢，已逐漸成為工業上用于流感疫苗生產的主流宿主細胞。在培養過程中各種因素均會導致細胞的特性變化，最終影響病毒增殖效率，但目前關于懸浮MDCK細胞穩定性的研究鮮有報道。本研究主要對不同代次懸浮MDCK細胞的生物學特性進行研究，包括細胞形態、生長特性、產毒情況、ROS以及細胞周期等，為基于懸浮MDCK細胞培養生產流感疫苗的工藝穩定性奠定基礎。

初步實驗表明，不同代次細胞在傳代過程與批培養過程中細胞生長均未表現出顯著性差異，與前人貼壁MDCK細胞生長研究結果類似［7］，并且細胞形態相似。此外，李自良等［12］將貼壁MDCK細胞馴化成功后，發現相差20代的懸浮MDCK細胞的生長穩定性較好，雖與本研究結果相似，但本文細胞代次差距達110代，更能說明懸浮MDCK細胞生長穩定性。在各代次細胞病毒生產過程中，隨著細胞代次的增加病毒產量有增加趨勢，與前人貼壁MDCK細胞產毒結果相反［8］。說明長期傳代后懸浮MDCK細胞的變化情況并不完全符合貼壁細胞變化規律，故而針對懸浮MDCK細胞進行穩定性研究，在動物細胞懸浮工藝生產流感疫苗中更具應用價值。

隨后，在不同稀釋比例以及不同MOI工藝參數條件下進行接毒實驗，驗證病毒產量隨細胞代次的變化情況，發現P111細胞的產量始終高于P1細胞，說明改變維持培養基營養物濃度和MOI這兩個外部條件均不可改變P111細胞的高產結果，進一步確定P111細胞的某些特性已經發生變化并導致病毒產量提高。為初步探索P111細胞高產原因，在檢測ROS水平與細胞周期分布時發現P111細胞與P1細胞存在較大差異，相比于P1細胞，P111細胞的ROS水平較低、G0/G1期分布的細胞比例較高。

ROS是病毒感染復制過程中的一把雙刃劍，過高的ROS會導致細胞的凋亡［17］，破壞病毒復制的宿主環境；但抑制ROS生成又會阻礙病毒核糖核蛋白（RNP）的出核運輸，降低病毒產量［16］。本研究發現病毒感染后，胞內ROS水平會增加，與文獻報道相似［18］，病毒感染通過促使細胞ROS增多進而引發氧化應激反應，促進病毒增殖。但P111胞內ROS水平在0-6 hpi始終低于P1細胞。有研究發現降低ROS含量，可以緩解線粒體損傷，挽救細胞凋亡［16］，保持低水平ROS的P111細胞也許可以更好地維持細胞生理機能，從而為病毒復制提供更多中間代謝物。也有文獻報道低水平的ROS會介導細胞進入G0/G1期［19］，與本研究現象一致。有文獻報道G0/G1期細胞的膜剛性較差［20］，提高G0/G1期細胞分布，有利于病毒進入宿主細胞，并且G0/G1期的RNA聚合酶（Pol II）與帽結合蛋白活性較高，有利于病毒基因組的轉錄以及帽結構依賴性翻譯［21］。可見，P111細胞在病毒感染過程中ROS的生成并未受到抑制，但始終保持低水平ROS，為病毒的復制提供良好的宿主環境；同時G0/G1期細胞分布較高，促進了感染前期病毒進入宿主細胞以及病毒基因組的轉錄與翻譯，從而縮短了病毒復制周期，提高病毒產量。

4 結論

本研究使用實驗室自主研發培養基對實驗室已有懸浮MDCK細胞進行長達200多天的傳代培養，該細胞的細胞形態與生長能力并未發生顯著變化，但病毒產量有所提高。分析發現高代次懸浮MDCK細胞中ROS低水平、G0/G1期高分布的細胞群體含量有所提高，該細胞經過長期傳代后很可能是通過提供病毒良好的復制環境并縮短病毒復制周期，最終使流感病毒產量增加。