骨髓間充質干細胞玻璃體腔移植對大鼠青光眼模型視神經的保護作用

田洪益，謝碧華，羅清禮

0 引言

青光眼(glaucoma)是老年人群中常見的眼科疾病，具有不可逆性[1]。青光眼的特征是視網膜神經節細胞(retinal ganglion cells,RGCs)的進行性退化和不能分裂或再生，被視為神經干細胞生成性疾病，與其他疾病如阿爾茨海默氏癥或帕金森病一樣，最終由神經功能缺陷引起[2]。青光眼的臨床治療主要有藥物和手術治療，但其治療效果不是很理想，不能有效阻止視網膜神經節細胞凋亡[3]。間充質干細胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是一種能夠自我更新的多能干細胞，具有多向分化潛能和免疫調節作用，包括臍帶間充質干細胞、骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMMSCs)等[4]。其中，骨髓間充質干細胞是具有自我更新的非造血干細胞，具有多系分化潛能，能夠分化為多種細胞譜系，如：脂肪細胞、成骨細胞、表皮細胞等[5-6]。因此，本實驗研究骨髓間充質干細胞玻璃體腔移植是否對大鼠青光眼模型有改善作用，是否對視網膜神經節細胞有保護作用。

1 材料和方法

1.1 材料35只體質量180～220g Lewis大鼠購自中國科學院上海斯萊克實驗動物有限公司。IMDM培養基和胎牛血清購自美國Gibco公司。Percoll分離液、PBS溶液、茜素紅S、油紅O和葡聚糖四甲基羅丹明購自美國Sigma公司。pGFP-N試劑購自美國Clontech公司。CD29抗體、CD45抗體、CD44抗體、CD90抗體、CD106抗體和CD14抗體購自美國Abcam公司。HE試劑盒購自北京中杉金橋公司。RIPA裂解液購自北京索萊寶公司。IGF1抗體、BDNF抗體、β-actin抗體和山羊抗兔(鼠)IgG二抗購自美國Cell Signaling Technology公司。PVDF膜購自美國Millipore公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養取5只雄性Lewis大鼠，采用麻醉處死，立即用75%乙醇浸泡，移入超凈工作臺內，固定大鼠四肢于工作臺面的泡沫板上。酒精棉球擦拭，無菌條件下用滅菌消毒后的鑷子和剪刀分離出大鼠股骨，剔除骨頭表面肌肉，PBS溶液沖洗兩遍。將股骨兩端剪斷，用2mL無菌注射器吸取IMDM培養基沖出股骨中的骨髓于離心管中，反復沖洗幾次。將沖出的骨髓吹打成懸液，1000r/min離心5min，棄上清。IMDM培養基重懸細胞，將懸液加入到裝有等體積Percoll分離液的離心管中，用吸管吹打成細胞懸液，2000r/min，離心20min。吸取中間骨髓基質細胞層(白色混濁狀)，IMDM培養基洗3次。用含15%胎牛血清、100U/mL青霉素、100U/mL鏈霉素的IMDM培養基重懸。以1×106/mL接種于細胞培養瓶中，置于37℃、5%CO2的培養箱中培養。48h后棄去培養基，PBS溶液沖洗2～3次去除未貼壁細胞，加入完全培養基繼續培養。以后每3d換液1次，以保證細胞所需的營養成分，并于倒置顯微鏡下觀察細胞生長的形態變化。

1.2.2 骨髓間充質干細胞的體外分化對于成骨分化，將骨髓間充質干細胞在含有100nmol/mL地塞米松，0.05mmol/mL抗壞血酸-2-磷酸和10mmol/mL β-甘油磷酸酯的完全培養基中培養4wk，進行成骨分化。通過用2%茜素紅S(pH 4.1～4.3)染色評估。對于成脂分化，通過在含有0.5mmol/mL異丁基-甲基黃嘌呤，100nmol/L地塞米松，10mg/mL胰島素和200μmol/mL吲哚美辛的完全培養基中培養骨髓間充質干細胞，進行脂肪形成分化2wk。通過用0.5%油紅O染色細胞內脂滴來顯示脂肪形成分化。

1.2.3 流式細胞術在第3代后，收獲骨髓間充質干細胞。每1mL細胞懸液中加入20μL 抗體(CD29抗體、CD45抗體、CD44抗體、CD90抗體、CD106抗體、CD14抗體)，室溫、避光孵育30min后，1000r/min離心5min，棄去上清液。PBS清洗細胞后加入培養基重懸細胞，使用FACS Calibur儀器進行流式細胞術分析。用Cell Quest軟件分析數據。

1.2.4 動物分組及給藥將30只Lewis大鼠飼養在有鋸屑墊料的標準塑料籠中，室內溫度為21℃±2℃，動物可以不受限制地獲得食物和水，保持12h光照/12h黑暗循環，并且在實驗之前使大鼠適應環境至少2wk。將大鼠分別隨機分為3組：(1)對照組：建模后第7d向玻璃體腔內注射3μL PBS溶液；(2)青光眼模型組：建模后第7d向玻璃體腔內注射3μL PBS溶液；(3)骨髓間充質干細胞組：在建模后第7d向玻璃體腔內注射3μL骨髓間充質干細胞懸浮液(含有1×105個細胞)，連續給藥30d。

1.2.5 模型制作按照文獻[7]進行青光眼模型制作。Lewis大鼠經戊巴比妥鈉全身麻醉，將每只大鼠的左眼為實驗眼(青光眼)，右眼為對照眼。實驗前測量每只眼的眼內壓，在裂隙燈下，從532nm二極管激光器向左眼施加0.75W脈沖(直徑50μm，0.5s)，經過50個激光脈。在第7、14、21、30d測雙眼眼內壓，實驗眼內壓比對照眼內壓大于10mmHg(1mmHg=0.133kPa)為青光眼模型制作成功。對照組只麻醉大鼠，不進行手術。動物實驗設計計劃嚴格經過成都市第一人民醫院倫理委員會審查。

1.2.6 HE染色將視網膜組織快速在10%福爾馬林溶液中固定24h。固定后，視網膜組織樣品包埋于石蠟中并進行切片(切片的厚度5μm)。將5μm厚的組織固定在帶正電荷的載玻片上，然后進行脫水-再水化，切片進行蘇木精-曙紅染色。所有切片均用光學顯微鏡進行拍攝。

1.2.7 視網膜神經節細胞計數葡聚糖四甲基羅丹明(DTMR)鹽溶液(終濃度1mg/mL)從大鼠玻璃體腔注入，給予DTMR 48h后，將進行免疫熒光分析的動物處死，并摘除眼球。將眼球在甲醛中固定2h，然后將視網膜移出并平放，使用PBS/甘油(1∶1)將RGC層置于最上方，并標記上視網膜的方向。將平置的視網膜放置在顯微鏡載玻片上，并使用適當的濾光片套件立即用免疫熒光顯微鏡進行檢查，通過圖像分析軟件Image Pro Plus對圖像進行計數。

1.2.8 TUNEL染色視網膜組織經固定、OCT包埋，并制作成6μm厚的冰凍切片。切片滴加蛋白酶K工作液(20μg/mL)，37℃溫育10～30min，PBS清洗3次。接著切片在4%的多聚甲醛溶液中室溫固定5min，PBS清洗3次。然后切片上滴加DNse I反應液，37℃溫育30min，PBS清洗3次。用吸水紙小心吸去樣本區域周圍的多余液體，滴加TdT酶反應液于樣本區域上，于37℃濕盒中孵育60min(避光)，PBS清洗3次。用吸水紙小心吸去樣本周圍的液體，每個樣本上滴加Streptavidin-Fluorescein標記液，放入溫盒中，37℃反應30min(避光)，PBS清洗3次。最后DAPI染色液復染細胞核，室溫避光反應10min，PBS洗滌，加適量封片劑，熒光顯微鏡觀察并拍照。

圖1 骨髓間充質干細胞形態(×100) A:第0代，第5d；B:第3代，第4d。

圖2 骨髓間充質干細胞的體外分化 A：成骨分化(×100)；B：成脂分化(×200)，藍色表示細胞核。

圖3 流式細胞術檢測BMMSCs的免疫表型特征。

1.2.9 Western blot視網膜組織中加入1mL制備好的RIPA裂解液提取蛋白，用BCA法測定總蛋白含量。用12% SDS-PAGE凝膠分離蛋白質并轉移到PVDF膜上。用含有5%脫脂牛奶的PBS封閉膜1h，之后加入稀釋后的胰島素樣生長因子1(insulin-like growth factor 1,IGF1)(1∶1000)、腦源性神經營養因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)(1∶1000)和β-actin(1∶1000)一抗，4℃搖床上孵育過夜。TBST洗膜3次，每次10min，加入對應于一抗種屬來源的HRP標記的二抗(1∶2000)，在室溫搖床上孵育1h，TBST洗膜3次，每次10min。使用ECL化學發光液顯色發光，凝膠成像系統拍照，Image Pro Plus圖像分析系統對蛋白條帶進行分析。

2 結果

2.1 骨髓間充質干細胞的形態如圖1所示，原代培養第5d出現小集落，細胞形狀為類圓形；傳至第3代時，細胞呈現出大的，扁平的或成纖維細胞樣的形態。

2.2 骨髓間充質干細胞的體外分化如圖2所示，成骨誘導后，用茜素紅S染色將礦物結節染色為陽性；成脂誘導后，用油紅O染色發現中性脂質空泡；提示所提取的原代細胞為骨髓間充質干細胞。

2.3 流式細胞術實驗如圖3所示，流式細胞術分析數據表明BMMSCs表達CD29，CD44，CD90和CD106，但不表達CD45和CD14，并且它們在隨后的傳代中保持其表型。

2.4 大鼠青光眼模型鑒定由表1可以看出，20只大鼠對照眼、實驗眼的眼內壓在各時間點比較差異均有統計學意義(F時間=20.45，P時間<0.01；F組間=24.78，P組間<0.01；F組間×時間=18.34，P組間×時間<0.01)。在術后第7、14、21、30d時大鼠實驗眼的眼內壓均明顯高于對照眼，差異均有統計學意義(P<0.05)，表明青光眼大鼠模型均建造成功。

2.5 視網膜組織形態表現如圖4所示，對照組、青光眼模型組、骨髓間充質干細胞組大鼠視網膜厚度分別為345.67±23.12、203.45±13.56、287.89±18.23μm，差異有統計學意義(F=18.21，P<0.01)。對照組大鼠視網膜神經纖維排列整齊，視網膜神經節細胞數量多，視網膜厚度正常；與對照組比較，青光眼模型組大鼠視網膜神經纖維排列不整齊，視網膜神經節細胞數量明顯減少，視網膜厚度變薄(P<0.01)；骨髓間充質干細胞組大鼠視網膜神經纖維細胞排列較整齊，視網膜神經節細胞數量和視網膜厚度高于青光眼模型組(P<0.05)。

圖4 HE染色觀察各組大鼠視網膜厚度變化(×200) 單箭頭：視網膜神經節細胞；雙箭頭：視網膜厚度。A：對照組；B：青光眼模型組；C：骨髓間充質干細胞組；D：三組大鼠視網膜厚度比較。bP<0.01 vs 對照組；cP<0.05 vs 青光眼模型組。

表1 對照眼和實驗眼術后第7、14、21、30d的眼內壓

2.6 視網膜神經節細胞計數如圖5所示，對照組、青光眼模型組、骨髓間充質干細胞組大鼠視網膜神經節細胞數量分別為1267.34±67.32、632.56±34.78、1057.21±58.32個/mm2，差異有統計學意義(F=21.74，P<0.01)。青光眼模型組大鼠視網膜神經節細胞數量明顯低于對照組(P<0.01)，BMMSCs組大鼠的視網膜神經節細胞數量高于青光眼模型組(P<0.05)。

2.7 視網膜神經節細胞凋亡如圖6所示，對照組、青光眼模型組、骨髓間充質干細胞組大鼠視網膜神經節細胞凋亡數量分別為0.68±0.10、5.75±1.13、3.34±0.78個，差異有統計學意義(F=67.58，P<0.001)。青光眼組大鼠視網膜神經節細胞凋亡數量顯著高于對照組(P<0.001)，骨髓間充質干細胞組大鼠的視網膜神經節細胞凋亡數量明顯低于青光眼模型組(P<0.05)。

2.8 Western blot如圖7所示，對照組、青光眼模型組、骨髓間充質干細胞組大鼠視網膜中IGF1和BDNF蛋白表達差異有統計學意義(F=25.62、28.60，均P<0.01)。青光眼模型組大鼠視網膜中IGF1(0.21±0.07)和BDNF(0.18±0.04)蛋白表達量明顯低于對照組(0.57±0.11，0.49±0.12)(均P<0.01)，骨髓間充質干細胞組大鼠視網膜中IGF1(0.38±0.06)和BDNF(0.29±0.05)蛋白表達量高于青光眼模型組(均P<0.05)。

3 討論

圖5 免疫熒光顯微鏡下視網膜神經節細胞數量變化 bP<0.01 vs對照組；cP<0.05 vs青光眼模型組。

青光眼是一種視神經病變，其特征在于視網膜神經節細胞的進行性退化。青光眼影響全球7000多萬人，其中約10%是雙眼失明，使其成為不可逆轉性失明的主要原因[8]。青光眼可分為兩大類：開角型青光眼和閉角型青光眼。在美國，超過80%的病例是開角型青光眼；然而，閉角型青光眼是造成嚴重視力喪失的重要原因。開角型和閉角型青光眼均可作為原發性疾病。繼發性青光眼可由創傷，某些藥物如皮質類固醇，炎癥，腫瘤或諸如色素分散或假去角質的病癥引起[9]。因此，早期診斷和治療可以預防視力喪失。青光眼的神經保護治療宗旨在預防視網膜神經節細胞的死亡。在某種程度上，降低眼壓可以在一定程度上保護神經，從而防止神經元的破壞和減少神經節的不可逆損失[10]。然而，目前沒有保護視網膜神經節細胞的預防性治療。

圖6 TUNEL染色觀察各組大鼠視網膜神經節細胞凋亡變化 bP<0.001 vs 對照組；cP<0.05 vs 青光眼模型組。

干細胞已經用于醫學領域的神經保護治療。研究發現，視網膜干細胞移植對青光眼視網膜神經節細胞有保護作用[11]，MSCs在神經保護療法中具有吸引力[12]。間充質干細胞分泌BDNF，神經生長因子，神經膠質細胞源性神經營養因子(GDNF)，睫狀神經營養因子(CNTF)，IGF1等各種細胞因子和神經營養因子[13]。這些由MSCs分泌的因子已被證明可對缺血[14]、腦缺血再灌注[15]等疾病具有

圖7 Western blot檢測各組大鼠視網膜中IGF1和BDNF蛋白變化 A：三組大鼠視網膜中IGF1和BDNF蛋白表達；B：三組大鼠視網膜中IGF1蛋白表達；C：三組大鼠視網膜中BDNF蛋白表達。bP<0.01 vs 對照組；cP<0.05 vs 青光眼模型組。

神經保護作用。研究表明，涉及青光眼治療中MSCs，BMMSCs在動物模型中有效維持視網膜神經節細胞活力[7]，并且BMMSCs治療青光眼被廣泛研究。在本研究中，我們將大鼠BMMSCs用于大鼠青光眼模型中來研究其對視網膜神經的神經保護和整合能力，是否對青光眼有保護作用。

本實驗探究骨髓間充質干細胞是否對青光眼大鼠模型有保護作用，我們先提取了大鼠原代骨髓間充質干細胞并進行了鑒定，得到純度高的骨髓間充質干細胞。接著，我們制作了大鼠青光眼模型，并檢測了大鼠眼內壓，結果表明青光眼大鼠模型均建造成功。為了進一步探究骨髓間充質干細胞經玻璃體腔移植后的作用，進行了如下實驗：HE染色結果表明，對照組大鼠視網膜神經纖維排列整齊，視網膜神經節細胞數量多，視網膜厚度正常，青光眼組大鼠視網膜神經纖維排列不整齊，視網膜神經節細胞數量明顯減少，視網膜厚度變薄，骨髓間充質干細胞組大鼠視網膜神經纖維細胞排列較整齊，視網膜神經節細胞數量和視網膜厚度明顯高于青光眼組；視網膜神經節計數結果表明，青光眼模型組大鼠視網膜神經節細胞數量明顯低于對照組，骨髓間充質干細胞組大鼠的視網膜神經節細胞數量明顯高于青光眼組，但低于對照組；TUNEL染色結果表明，青光眼模型組大鼠視網膜神經節細胞凋亡數量顯著高于對照組，骨髓間充質干細胞組大鼠的視網膜神經節細胞凋亡數量明顯低于青光眼模型組；Western blot結果表明，青光眼模型組大鼠視網膜中IGF1和BDNF蛋白表達量明顯低于對照組，骨髓間充質干細胞組大鼠的視網膜中IGF1和BDNF蛋白表達量高于青光眼模型組。因此，骨髓間充質干細胞玻璃體腔移植能治療大鼠青光眼，可以保護視網膜神經節細胞。

綜上所述，骨髓間充質干細胞的玻璃體腔移植可以在體內抑制視網膜神經節細胞凋亡，對視網膜神經節細胞具有保護作用，其中間充質干細胞分泌多種細胞因子和生長因子，在青光眼病理過程中對神經節細胞的保護起關鍵作用。