黃連解毒湯對(duì)人胃癌SGC-803細(xì)胞株作用的實(shí)驗(yàn)研究

高東霞　蓋廣東　張士剛　李加慶　孫付軍　桑曉光　殷曉敏　孫通華

【摘 要】 目的：觀察黃連解毒湯對(duì)人胃癌細(xì)胞株SGC-803的作用及其機(jī)制。方法：體外培養(yǎng)胃癌細(xì)胞株SGC-803，應(yīng)用黃連解毒湯干預(yù)胃癌SGC-803細(xì)胞。運(yùn)用CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)SGC-803細(xì)胞增殖;劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力;流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡水平;qRT-PCR法檢測(cè)細(xì)胞相關(guān)基因mRNA的表達(dá)水平。結(jié)果：CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，黃連解毒湯可有效抑制胃癌MGC-803細(xì)胞株的增殖，且呈現(xiàn)出藥物濃度依賴性及時(shí)間依賴性。劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，黃連解毒湯干預(yù)的實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞遷移率的增長(zhǎng)明顯慢于對(duì)照組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示，黃連解毒湯可以有效促進(jìn)胃癌細(xì)胞的凋亡，實(shí)驗(yàn)組MGC-803細(xì)胞的細(xì)胞凋亡率與對(duì)照組相比均有顯著性差異（P<0.05）。qRT-PCR結(jié)果顯示，經(jīng)黃連解毒湯干預(yù)，Bax、Caspase3基因mRNA表達(dá)上調(diào)，Bcl-2基因mRNA表達(dá)下調(diào)。結(jié)論：黃連解毒湯能夠通過誘導(dǎo)SGC-803抑制胃癌細(xì)胞MGC-803增殖，抑制胃癌細(xì)胞遷移能力，推測(cè)其機(jī)制可能是通過影響凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax的表達(dá)，發(fā)揮抗腫瘤作用。

【關(guān)鍵詞】 黃連解毒湯;SGC-803;細(xì)胞凋亡

【中圖分類號(hào)】R285.5?? 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A??? 【文章編號(hào)】1007-8517（2020）18-0017-04

Experimental Study on the Effect of Huanglianjiedu Decoction on SGC-803

GAO Dongxia1 GAI Guangdong1 ZHANG Shigang2 LI Jiaqing3 SUN Fujun4 SANG Xiaoguang5* YIN Xiaomin5 SUN Tonghua5

1.Yinan? Maternal and Child Health Hospital，Shandong Province，Yinan 276300，China;

2.Taian? traditional Chinese Medicine Hospital，? Shandong Province， Taian 271000，China;

3.Yinan? peoples Hospital，? Shandong Province， Yinan 2763004，China;

Shandong Institute of traditional Chinese Medicine， Shandong Province， Jinan? 250014，China;

5.Shouguang peoples Hospital，? Shandong Province， Shouguang 262700，China

Abstract：Objective To observe the effect of Huanglianjiedu Decoction on SGC-803 and its mechanism. Methods SGC-803 was cultured in vitro， and SGC-803 were interfered with Huanglianjiedu Decoction with different concentrations. CCK-8 experiment was used to detect the proliferation of SGC-803; scratch test was used to detect the cell migration ability; flow cytometry was used to detect the apoptosis level; qRT-PCR method was used to detect the cell-related gene mRNA expression level. Results The results of the CCK-8 experiment showed that Huanglianjiedu Decoction can effectively inhibit the proliferation of MGC-803， and showed drug concentration and time dependence. The results of scratch experiments showed that Huanglianjiedu Decoction interfered with the cells in the experimental group. The increase of migration rate was significantly slower than that of the control group， with a statistical difference （P<0.05）. Apoptosis detected by flow cytometry showed that Huanglian jiedu Decoction can effectively promote the apoptosis of gastric cancer cells. Compared with the control group， the apoptosis rate was significantly different （P<0.05）; qRT-PCR results showed that with the intervention of Huanglianjiedu Decoction， the mRNA expression of Bax and Caspase3 was up-regulated， and the mRNA expression of Bcl-2 was down-regulated. Conclusion Huanglianjiedu Decoction can inhibit the proliferation of MGC-803 by inducing SGC-803 and inhibit the migration ability of gastric cancer cells. It is speculated that the mechanism may be to exert anti-tumor effects by affecting the expression of apoptosis-related proteins Bcl-2 and Bax.

Keywords：Huanglianjiedu Decoction;SGC-803;Apoptosis

胃癌（Gastric Carcinoma， GC）是最常見的消化道系統(tǒng)腫瘤，目前仍是影響全球的一大健康問題，其發(fā)病率在腫瘤中高居第五，死亡率高居第三[1]。在我國(guó)胃癌發(fā)病率也一直居高不下。盡管早期胃癌患者可通過手術(shù)治療，然而胃癌的復(fù)發(fā)，轉(zhuǎn)移及耐藥等問題仍然令人堪憂。中藥因其表現(xiàn)出增效減毒作用，是治療惡性腫瘤中的重要組成部分，因此，尋找一種能夠提高治療胃癌療效的中藥具有重要的意義。

黃連解毒湯由黃連、黃芩、黃柏、梔子組成，是常用清熱解毒代表方劑之一，可瀉火解毒、涼血止血。現(xiàn)代報(bào)道該方含有小檗堿、黃芩素等[2]抗腫瘤活性成分，有明顯抑制惡性腫瘤的作用[3]。近年來已有研究把黃連解毒湯用于腫瘤治療，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)[4-5]，黃連解毒湯對(duì)小鼠體內(nèi)、體外腫瘤生長(zhǎng)均有抑制作用。現(xiàn)為進(jìn)一步研究黃連解毒湯抗腫瘤療效，本實(shí)驗(yàn)采用體外培養(yǎng)技術(shù)，以人胃癌細(xì)胞SGC-803模型，探究黃連解毒湯抑制其增殖、遷移及凋亡情況，為黃連解毒湯治療胃癌的臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料

1.1 藥物 黃連解毒湯由黃連、黃芩、黃柏、梔子按原方比例（3∶2∶2∶3）配制而成。將全部藥物混合，浸泡，煎煮，二煎后均勻混合，置于蒸發(fā)儀上，濃縮為1.4 g/mL的黃連解毒湯;藥液1200 rpm離心兩次后取上清，置于微量離心管，1300 rpm5 min超速離心一次;集上清，0.22 μm 微孔濾膜過濾除菌后于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 細(xì)胞株 SGC-803 胃癌細(xì)胞株（購(gòu)于南京凱基生物科技發(fā)展有限公司）。

1.3 試劑 胎牛血清（杭州天杭生物科技公司公司）;RPMI-1640 液體培養(yǎng)基（含10%FBS，青霉素100U/L，鏈霉素100U/L，賽默飛世爾科技公司）;CCK-8試劑盒（亞科因生物技術(shù)公司）;AnnexinV/FITC 試劑盒及線粒體膜電位試劑盒（貝博生物公司）;Bcl-2、Bax、Caspase3 等購(gòu)自武漢三鷹生物技術(shù)公司。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 選用10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基進(jìn)行人胃癌MGC-803細(xì)胞培養(yǎng)。在37 ℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3 d傳代一次，細(xì)胞呈單層貼壁生長(zhǎng)，在細(xì)胞達(dá)到指數(shù)增長(zhǎng)期時(shí)開展實(shí)驗(yàn)，制成單細(xì)胞懸液，按所需濃度接種使用。

2.2 CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制率 實(shí)驗(yàn)共分3組：空白組;對(duì)照組：培養(yǎng)基（90%RPMI1640+10%FBS）;實(shí)驗(yàn)組：設(shè)0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%五個(gè)不同中藥濃度（用培養(yǎng)基配制）。CCK-8增殖檢測(cè)試劑盒測(cè)定細(xì)胞活力，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期MGC-803細(xì)胞制備細(xì)胞混懸液;調(diào)整細(xì)胞濃度為5×104/mL，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù);接種于96孔板，每孔加培養(yǎng)液100 μL，每孔細(xì)胞數(shù)為5000個(gè)，每組設(shè)平行6個(gè)復(fù)孔，共鋪3塊96孔板;按設(shè)計(jì)對(duì)不同實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞進(jìn)行加藥，于培養(yǎng)箱中按不同時(shí)間段分別培養(yǎng)24 h、48 h、72 h，檢測(cè)時(shí)吸出相應(yīng)的96孔板內(nèi)液體，反應(yīng)液取CCK-8和培養(yǎng)基以1∶[KG-*2]9的比例配置，每孔加入100 μL，繼續(xù)培養(yǎng)2 h;[JP3]置于全自動(dòng)酶標(biāo)儀中，設(shè)定參數(shù)（波長(zhǎng)490 nm、中等強(qiáng)度震蕩10 min），檢測(cè)各孔的OD值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，并記錄結(jié)果。抑制率（%）=[1-（實(shí)驗(yàn)組OD值-空白組OD值）/（對(duì)照組OD值-空白組OD值）]×100%。

2.3 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移率 對(duì)照組：RPMI-1640;實(shí)驗(yàn)組：黃連解毒湯（濃度：MGC-803細(xì)胞用RPMI-1640配制）。調(diào)整細(xì)胞濃度為1.5×105/mL為細(xì)胞計(jì)數(shù);將細(xì)胞接種于6孔板，每孔2mL;待細(xì)胞密度至70%～80%時(shí)，用100μL規(guī)格槍頭劃痕;PBS輕柔洗滌2次，去除漂浮細(xì)胞;顯微鏡拍照記錄初始劃痕范圍;按設(shè)計(jì)對(duì)不同實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞進(jìn)行加藥，繼續(xù)培養(yǎng);24h、48h后，再次拍照記錄細(xì)胞劃痕范圍，計(jì)算細(xì)胞遷移率。細(xì)胞遷移率=迀移距離/劃痕寬度×100%

2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 對(duì)照組：培養(yǎng)基（90%RPMI1640+10%FBS）;實(shí)驗(yàn)組：黃連解毒湯水提物（濃度：MGC-803細(xì)胞，用培養(yǎng)基配制）。在含90%RPMI1640+10%FBS的培養(yǎng)液中常規(guī)培養(yǎng)細(xì)胞，消化細(xì)胞，離心5 min，棄上清，收集細(xì)胞;用培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，計(jì)數(shù)細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1.5×105/mL，接種于細(xì)胞培養(yǎng)皿中培養(yǎng)細(xì)胞，使細(xì)胞貼壁，培養(yǎng)至細(xì)胞基本覆蓋培養(yǎng)皿底部。加入黃連解毒湯的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。48 h后從培養(yǎng)箱中取出，收集細(xì)胞培養(yǎng)液，冷PBS洗滌細(xì)胞2次，消化，收集所有細(xì)胞。離心，再用PBS洗細(xì)胞2次，吸棄PBS。加入400 μL×Binding Buffer緩沖液重懸細(xì)胞;將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至流式管中;加入 Annexin V-FITC和5 μL PI，在避光處輕輕混勻，孵育細(xì)胞15 min;1 h內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

2.5 qRT-PCR檢測(cè)細(xì)胞相關(guān)基因mRNA的表達(dá) 對(duì)照組：培養(yǎng)基（90%RPMI1640+10%FBS）;實(shí)驗(yàn)組：黃連解毒湯（濃度：MGC-803細(xì)胞，用培養(yǎng)基配制）。收集黃連解毒湯水提物處理過的MGC-803細(xì)胞總RNA，以其反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板，β-actin為內(nèi)參進(jìn)行qRT-PCR 檢測(cè)，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。得到的數(shù)據(jù)采用2–ΔΔCt計(jì)算獲得細(xì)胞中Bcl-2、Bax、Caspase3 mRNA 的相對(duì)表達(dá)量。利用PrimerPremier5.0軟件設(shè)計(jì)引物，β-actin上游引物為5′-AACAAGATGAGATTGGCA-3′，下游引物為5′-AGTGGGGTGGCTTTTAGGAT-3′;Bcl-2上游引物為5′-CGACTTCGCCGAGATGTCCA-3′，下游引物為 5′-TTGACTTCACTTGTGGCCCA-3′;Bax上游引物為 5′-ATGATTGCCGCCGTGGACAC-3′，下游引物為 5′-CCACCCTGGTCTTGGATCCA-3′;Caspase3上游引物為 5′-CATGGAAGCGAATCAATGGACT-3′，下游引物為 5′-CTGTACCAGACCGAGATGTCA -3′。增反應(yīng)程序結(jié)束后，以2–ΔΔCt方法計(jì)算目的基因mRNA相對(duì)表達(dá)量。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 統(tǒng)計(jì)分析應(yīng)用SPSS 25.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)以（x±s）表示，組間比較采用檢驗(yàn)χ2檢驗(yàn)，P<0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 黃連解毒湯不同濃度、時(shí)間對(duì)MGC-803細(xì)胞増殖的抑制率 由表1可知，隨著黃連解毒湯用藥濃度及用藥時(shí)間的增加，胃癌MGC-803細(xì)胞增殖水平被逐漸抑制，呈現(xiàn)時(shí)間及濃度依賴性，與對(duì)照組、空白組比較具有顯著差異（P<0.01）。

3.2 黃連解毒湯對(duì)MGC-803細(xì)胞遷移的影響 由表2可知，在同一作用時(shí)間，黃連解毒湯干預(yù)的實(shí)驗(yàn)組MGC-803細(xì)胞的遷移率較對(duì)照組顯著下降（P<0.01），提示黃連解毒湯對(duì)胃癌MGC-803細(xì)胞遷移能力明顯抑制。

3.3 黃連解毒湯不同濃度、時(shí)間對(duì)MGC-803細(xì)胞凋亡的影響 由表3可知，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示，同一作用時(shí)間，不同濃度黃連解毒湯干預(yù)下MGC-803細(xì)胞的細(xì)胞凋亡率均高于對(duì)照組（P<0.01）。

3.4 黃連解毒湯對(duì)胃癌細(xì)胞相關(guān)基因mRNA表達(dá)的影響 由表4可知，qRT-PCR結(jié)果顯示，經(jīng)黃連解毒湯干預(yù)后Bax、Caspase3 基因mRNA表達(dá)上調(diào)，Bcl-2基因mRNA表達(dá)下調(diào)，與對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

5 討論

黃連解毒湯，君以黃連入上焦而清心除煩、入中焦而祛濕熱之邪;臣以黃芩、黃柏相伍，黃芩以攻中上焦?jié)駸幔S柏以走下焦而除濕熱諸證;佐以梔子通瀉三焦?jié)駸幔鹣滦校乃幭噍o相成，共奏瀉火解毒、治療三焦火毒之效。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，腫瘤其證多屬本虛標(biāo)實(shí)，胃為倉(cāng)廩之官，受納腐熟水谷，脾胃運(yùn)化失司，濕熱蘊(yùn)結(jié)，氣血熱毒瘀滯，胃絡(luò)被熱毒所傷而致血敗肉腐，發(fā)生病變。黃連解毒湯以清熱解毒為法，清解蘊(yùn)結(jié)之熱毒，是治療胃癌的主要治法之一。本實(shí)驗(yàn)采用經(jīng)典的黃連解毒湯干預(yù)胃癌MGC-803細(xì)胞，該方被證實(shí)具有抗腫瘤作用，其有效成分小檗堿、黃芩素等抗腫瘤活性成分，有明顯抑制惡性腫瘤的作用，可通過抑制腫瘤細(xì)胞分裂，從而抑制其增殖[3]。

研究以人胃癌MGC-803細(xì)胞作為研究對(duì)象，對(duì)黃連解毒湯的抗癌作用及機(jī)制進(jìn)行了相關(guān)探索。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著黃連解毒湯的濃度及用藥時(shí)間的增加，MGC-803細(xì)胞增殖水平被逐漸抑制，且呈現(xiàn)出藥物濃度及時(shí)間依賴性;在藥物作用24h、48h時(shí)，MGC-803細(xì)胞的早期、晚期凋亡率均有升高，隨給藥濃度的增高，凋亡率明顯上升，由此可見，黃連解毒湯可以有效促進(jìn)胃癌細(xì)胞的凋亡，且可能主要作用于早期凋亡，并呈一定濃度相關(guān)性。細(xì)胞的增殖與凋亡始終保持動(dòng)態(tài)平衡，可維持細(xì)胞群體數(shù)量的穩(wěn)定，當(dāng)動(dòng)態(tài)平衡被打破，細(xì)胞凋亡失常，成為腫瘤形成的重要病理基礎(chǔ)之一，參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程。認(rèn)為黃連解毒湯通過抑制胃癌MGC-803細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)其凋亡，是黃連解毒湯方降低胃癌患者復(fù)發(fā)率及轉(zhuǎn)移率的重要途徑之一。經(jīng)黃連解毒湯干預(yù)后Bax、Caspase3 基因mRNA表達(dá)上調(diào)，Bcl-2基因mRNA表達(dá)下調(diào)。報(bào)道證實(shí)[6]Bax和Bcl-2是Bcl-2蛋白家族成員之一，與細(xì)胞凋亡和腫瘤發(fā)生發(fā)展有關(guān)。這與本次研究結(jié)果相符，黃連解毒湯可誘導(dǎo)MGC-803凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平發(fā)生改變，Bcl-2表達(dá)量下降，Bax表達(dá)量上升，Bcl-2/Bax比值下降。此外，有研究表明，Bcl-2/Bax在線粒體中定位決定凋亡的發(fā)生，其比值與凋亡水平有關(guān)[7]。以上研究結(jié)果表明，黃連解毒湯誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞MGC-803凋亡，可能是通過線粒體途徑。本實(shí)驗(yàn)揭示了黃連解毒湯抗胃癌侵襲的作用機(jī)制，為開發(fā)新型抗胃癌藥提供了中藥的理論依據(jù)，更好的將基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究成果應(yīng)用至臨床工作中，從而建立最有效的治療手段。

綜上所述，黃連解毒湯能夠通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡抑制胃癌細(xì)胞MGC-803增殖，并且還抑制胃癌細(xì)胞遷移能力。此外，還可能通過影響凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax的表達(dá)，從而發(fā)揮抗腫瘤作用。然而，細(xì)胞信號(hào)通路極其復(fù)雜，對(duì)胃癌細(xì)胞作用是否還影響信號(hào)通路及存在更多的潛在作用機(jī)制，目前仍不清楚。盡管如此，研究結(jié)果證實(shí)了黃連解毒湯具有明顯抗腫瘤作用，可能會(huì)是治療胃癌一種新的治療策略，為臨床胃癌治療提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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（收稿日期：2020-05-02 編輯：劉斌）

基金項(xiàng)目：2020年濰坊市中醫(yī)藥科技項(xiàng)目（2020-4-117）。

作者簡(jiǎn)介：高東霞（1977- ），女，漢族，本科，主治醫(yī)師，研究方向?yàn)橹形麽t(yī)結(jié)合防治腫瘤及婦產(chǎn)科疾病。E-mail：gdx529@126.com

通信作者：桑曉光（1980- ），男，漢族，碩士，主治醫(yī)師，研究方向?yàn)橄到y(tǒng)疾病的基礎(chǔ)與臨床。E-mail：sangxg2013@163.com