纖維素酶輔助超聲提取葒草素2″-O-β-L半乳糖苷工藝研究

希力阿扎提?阿不力米提　姚雨含　詹羽姣　王亮　趙軍

【摘 要】 目的：優化阿爾泰金蓮花葒草素2″-O-β-L半乳糖苷（OGA）的纖維素酶輔助超聲提取工藝。方法：以OGA提取率為考察指標，通過單因素試驗考察pH、酶添加量、料液比、提取時間和提取溫度對OGA提取率的影響， 進一步采用Box-Behnken中心組合試驗及響應面分析優化阿爾泰金蓮花OGA的纖維素酶輔助超聲提取工藝。結果：最佳提取工藝條件為pH=4、料液比1∶40、超聲功率90W、酶添加量1.5%、乙醇濃度48.0%、超聲時間38.0 min、超聲溫度 40 ℃;在此條件下，OGA提取率達到了2.7%以上。結論：該工藝簡單高效，可用于葒草素2″-O-β-L半乳糖苷的提取。

【關鍵詞】 阿爾泰金蓮花;葒草素2″-O-β-L半乳糖苷;響應面法;纖維素酶;提取

【中圖分類號】R284.2?? 【文獻標志碼】 A??? 【文章編號】1007-8517（2020）18-0052-06

Study on Cellulase-Assisted Ultrasonic Extraction of Orientin 2″-O-β-L Galactoside from Trollius altaicus

XILIAZHATI Abulimiti1 YAO Yuhan2 ZHAN Yujiao2 WANG Liang2 ZHAO Jun2*

1.College of Life Science and Technology， Xinjiang University， Urumqi 830046， China;

2. Xinjiang Key Laboratory for Uighur Medicine， Institute of Materia Medica of Xinjiang， Urumqi 830004， China

Abstract：Objective To optimize cellulase-assisted ultrasonic extraction technology of Orientin 2″-O-β-L galactoside （OGA） from Trollius altaicus. Methods Taking the extraction rate of OGA as the index， the influence of pH， amount of enzyme， solid-liquid ratio， extraction time， power and temperature on the yield rate of OGA were investigated. Furthermore， the extraction process of OGA was optimized by box-behnken central combination test and response surface analysis. Results The optimum extraction conditions were pH=4， solid-liquid ratio 1∶40， ultrasonic power 90 W， enzyme dosage 1.5%， ethanol concentration 48.0%， ultrasonic time 38.0 min， and ultrasonic temperature 40.0℃. Under these conditions， the extraction rate of OGA was more than 2.7%.Conclusion The process is simple and efficient， and can be used for OGA extraction.

Keywords：Trollius Altaicus; Orientin 2″-O-β-L Galactoside; Response Surface Analysis; Cellulase; Extraction

阿爾泰金蓮花Trollius altaicus是毛茛科金蓮花屬多年生草本植物，主要分布于我國新疆阿勒泰、塔城地區，具有清熱解毒、止血止咳等功效，其干燥花蕾在臨床上多用于上呼吸道感染、急慢性咽炎和扁桃體炎等疾病的治療，收載于《哈薩克藥志》等醫藥文獻中[1-2]。黃酮碳苷類化合物是該藥材主要特征性化合物，其中以葒草素2″-O-β-L-半乳糖（OGA）的含量最高[3-5]。然而，對該化合物的研究文獻報道較少。因此，在前期研究基礎上，本實驗擬通過Box-Behnken中心組合實驗設計優化阿爾泰金蓮花OGA的纖維素酶輔助超聲提取工藝，為阿爾泰金蓮花及其OGA的開發利用提供參考依據。

1 儀器與材料

1.1 儀器 LC-10ATvp 型高效液相色譜儀（日本島津公司）;AL204 型分析天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）;AS系列超聲波清洗機（天津歐特賽恩斯儀器有限公司）;DZKW-S-4電熱恒溫水浴鍋（北京市永光明醫療儀器有限公司）;SHB-III 型循環水式多用真空泵（上海知信實驗儀器技術有限公司）;ST-02A 型小型粉碎機（永康市帥同工具有限公司）。

1.2 材料 阿爾泰金蓮花藥材于2018年7月采自新疆阿勒泰地區，經新疆藥物研究所何江研究員鑒定為阿爾泰金蓮花T.altaicus的干燥花蕾，藥材粉碎，過40目篩。葒草素2″-O-b-L-半乳糖苷對照品（OGA，上海源葉生物科技有限公司，純度為98.0%）;纖維素酶（4×105U/g）購自上海如吉生物科技發展有限公司;色譜純乙腈和甲醇分別購自美國 Fishe公司）;去離子水（烏魯木齊市雪白真純凈水有限公司）;其他試劑均為國產分析純。

2 方法及結果

2.1 阿爾泰金蓮花OGA的含量測定

2.1.1 色譜條件 色譜柱為Phenomenex Gemini C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）;流動相為乙腈（A）：0.2%磷酸水溶液（B）;梯度洗脫程序（0 min～10 min～15 min～20 min，15%A～19%A～25%A～15%A）;柱溫30℃;流速1.0 mL/min;檢測波長345 nm;進樣量 10 μL。

2.1.2 標準曲線繪制 精密稱取OGA對照品5.0 mg，置于25 mL量瓶中，加甲醇定容，制備成濃度為 0.20 mg/mL 的OGA對照品溶液。精密吸取OGA對照品溶液0.1、0.2、0.5、1.0、2.0 和5.0 mL，分別置于10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻。進樣10 μL，記錄峰面積。以峰面積為縱坐標（Y），OGA 質量濃度（mg/mL）為橫坐標（X），進行線性擬合，得回歸方程為 Y=1.690357752×107X+5.02805594×104，R2=0.9999，表明樣品在 0.002～0.1 mg/mL濃度范圍內對照品色譜峰面積與OGA質量濃度線性關系良好。

2.1.3 OGA的含量測定 取一定量阿爾泰金蓮花樣品，加入一定量的纖維素酶后，加入乙醇溶液，超聲提取后，滅酶（沸水浴5 min），過濾，濾液進液相，記錄峰面積，計算阿爾泰金蓮花OGA提取率（W）。

W=C×D×Vm×100%

式中：W為 OGA提取率（%）;C為提取液中OGA濃度（mg/mL）;D為溶液稀釋倍數;V為提取液體積（mL）;m為藥材質量（g）。

2.2 單因素考察

2.2.1 pH的確定 稱取藥材5份，每份1.0 g， 其中5份加入1.0%的纖維素酶，另外5份不加酶作為對照。每份樣品加入50倍量50%乙醇，以鹽酸緩沖液調 pH分別為 3、4、5、6后，于40 ℃功率90 W條件下超理 30 min酶解，滅酶，過濾，測定并計算OGA提取率。如圖1所示，在不同pH條件下，纖維素酶對OGA提取率的影響不同。隨著pH的增加，提取率呈現先增后降的趨勢、pH為4 時OGA提取率最高，過后逐漸降低，且加纖維素酶的提取率明顯高于不加酶的。

2.2.2 酶添加量對OGA提取率的影響 稱取藥材5份，每份1.0 g，分別加入0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、3.0%的纖維素酶后，加入50倍量50%乙醇，以鹽酸緩沖液調pH為4，于40℃功率90W條件下下超聲30 min后滅酶，過濾，測定并計算OGA提取率。從圖2可以看出，隨著酶添加量的增大，提取率呈增長趨勢，當酶添加量為1.5%時，提取率達到最高，大于1.5%后，提取率逐漸降低。

2.2.3 料液比對OGA提取率的影響 稱取藥材5份，每份1.0 g，每份樣品加入1.5% 的纖維素酶后，分別加入料液比為1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50的50%乙醇，以鹽酸緩沖液調 pH為4，于40 ℃功率90 W條件下超聲30 min酶解后滅酶，過濾，測定并計算OGA提取率。如圖3所示，隨著料液比的增大，OGA提取率逐步增大，當料液比為1∶40 時，提取率達到最高值，之后略有下降。

2.2.4 乙醇濃度對OGA提取率的影響 稱取藥材5份，每份1.0 g，每份樣品加入1.5%的纖維素酶后，分別加入50倍量30%、40%、50%、60%、70%乙醇，以鹽酸緩沖液調pH為4，于40 ℃功率90 W條件下超聲30 min酶解后滅酶，過濾，測定并計算OGA提取率。如圖4所示，隨著乙醇濃度（30%～50%）的增加，OGA提取率不斷增加，當乙醇濃度為50%時，提取率達到最高，隨著乙醇濃度的增大，提取率緩慢下降，可能是由于乙醇濃度的增加使提取液中雜質增多，限制了OGA的溶出，致使其提取率下降。

2.2.5 超聲溫度對OGA提取率的影響 稱取藥材1.0 g 5份，分別向其中加入1.5%的纖維素酶、50倍量50%乙醇，并以鹽酸緩沖液調 pH為4，于35、40、45、50、55 ℃，功率為90 W條件下超聲處理30 min酶解后滅酶，過濾，測定并計算OGA提取率。從圖5可以看出，溫度為40℃時，OGA提取率最高。溫度過高會導致酶變性失活，也會對有效成分造成一定程度的破壞。

2.2.6 超聲時間對OGA提取率的影響 稱取藥材5份，每份1.0 g，分別加入1.5%纖維素酶、50倍量50%乙醇，且以鹽酸緩沖液調pH為4，于40℃，功率90W條件下超聲處理10、20、30、40、50 min后滅酶，過濾，測定并計算OGA提取率。超聲時間短會影響酶解效果，時間過長不利于工業化生產，因此選擇合適的超聲時間對酶發揮最大作用和節約時間有雙重作用。從圖6可以看出，在超聲時間為40 min時，OGA提取率達到最高，之后，隨著超聲時間的增加，提取率反而呈下降趨勢。

2.2.7 超聲功率對OGA提取率的影響 稱取藥材5份，每份1.0 g，分別加入1.5%維素酶、50倍量50%乙醇，且以鹽酸緩沖液調 pH為4，在40℃功率分別為90、132、174、216、258、300 W條件下超聲處理30 min后滅酶，過濾，測定并計算OGA提取率。如圖7所示，隨著超聲功率的增加，OGA提取率整體呈下降趨勢，當超聲頻率為 90 W時，提取率為最高。故選擇提取的超聲頻率為90 W。

2.3 響應面試驗設計及優化結果 結合單因素試驗分析結果，依據Box-Behnken中心組合原理，優化酶輔助超聲提取阿爾泰金蓮花OGA的提取工藝條件。選擇酶添加量、乙醇濃度、超聲時間和超聲溫度四個因素為自變量，每一自變量的試驗分別以-1、0、1編碼，以OGA提取率（%）為響應值，進行四因素三水平實驗，利用Design-Expert 8.05軟件對試驗多元線性回歸和二項式擬合，并對擬合方程進行方差分析。因素水平設計見表1，試驗結果見表2。

以OGA提取率為指標，通過Design-Expert V 8.05軟件對表中試驗數據進行多元回歸擬合，獲得OGA提取率（Y）對酶添加量（A）、乙醇濃度（B）、超聲時間（C）和超聲溫度（D）四因素的二次多項回歸模擬方程為：Y=+2.77-0.020×A-0.052×B-0.018×C-0.019×D- 0.015×D-0.042×AB-0.048×AC-5.500E-003×AD+1.250E-003×AD-0.070×BC-8.750E-003×BD+1.667E-003×BD+4.500E-003×CD+0.014×CD-0.063×A2-0.065×B2-0.044×C2。

對該模型進行方差分析，結果如表3所示，該回歸模型F值0.15，P<0.0001，方程模型達到極顯著;決定系數R2=0.9582，校正系數Adj R2=0.8937;失擬項大于0.05，失擬不顯著，說明回歸方程擬合狀態良好;變異系數CV為0.9%，表明模型的重現性很好;因此可以利用此模型優化阿爾泰金蓮花OGA的酶輔助超聲提取條件。B、C的P值均小于0.01，說明乙醇濃度和提取時間對OGA提取影響極顯著。各因素對OGA得率影響大小順序為B>C>A>D。而AD、BD、CD的P值大于0.05，表明他們之間的作用對OGA提取率沒有顯著性影響。AB、AC、BC的P值小于0.01，說明酶添加量和乙醇濃度、提取時間，乙醇濃度和提取時間之間有明顯的交互作用。不同因子交互作用的響應面分析圖如圖8所示。通過 Design Expert 8.0.5 軟件分析得出阿爾泰金蓮花OGA纖維素酶輔助超聲提取的最佳工藝條件為：酶添加量1.50%，乙醇濃度48.49%，超聲時間38.31 min，超聲溫度40 ℃;在此工藝條件下，阿爾泰金蓮花理論預測提取率為2.81%。

2.4 驗證試驗 為檢驗響應面法優化后工藝的可靠性以及考慮實驗操作的可行性，結合單因素實驗結果，將上述提取工藝條件確定為：酶添加量1.50%，乙醇濃度48.0%，超聲時間38.0 min，超聲溫度40.0 ℃。在此條件下，進行3 組平行試驗，獲得阿爾泰金蓮花OGA提取率的均值為（2.79±0.03）%，與理論值的相對誤差為0.2%，回歸方程的預測值與實際實驗值相一致，說明運用響應面法優化得到的模型參數可靠準確，可真實地反映各因素對阿爾泰金蓮花OGA提取率的影響。

3 討論

阿爾泰金蓮花葒草素2″-O-β-L半乳糖苷（OGA）是連接有兩個糖的黃酮碳苷類化合物，水溶性較大，故采用低濃度的乙醇就可以將其較好的提取出來。然而乙醇濃度過低，會使過多水溶性雜質也被提取出來，導致其提取率降低;乙醇濃度過高，其溶解性降低，亦會減少提取率。在乙醇濃度為50%左右的提取條件下，提取率最高，驗證了這一推斷。采用纖維素酶輔助超聲波萃取法對OGA進行了提取工藝優化研究。該工藝通過纖維素酶水解破壞阿爾泰金蓮花的細胞壁，且在超聲作用下，藥材中所含黃酮類成分大量滲出，提取液中OGA含量得到較大提高。本研究以單因素實驗結果為基礎，通過響應面分析優化出阿爾泰金蓮花OGA的纖維素酶輔助超聲提取工藝，較優工藝條件為：pH為4、料液比1∶40、超聲功率90W、酶添加量1.5%、乙醇濃度48.0%、超聲時間38.0 min、超聲溫度40.0 ℃，在此工藝條件下阿爾泰金蓮花OGA提取率可達2.7%以上;且該方法簡單高效、成本低、易于操作。研究結果可為阿爾泰金蓮花及其OGA的深入研究提供基礎資料。

參考文獻

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（收稿日期：2020-04-16 編輯：程鵬飛）

基金項目：新疆維吾爾自治區自然科學基金項目 （2017D01B44）。

作者簡介：希力阿扎提·阿不力米提（1994-），男，維吾爾族，碩士，研究方向為中藥民族藥的研究與開發。E-mail：18448438qq@qq.com

通信作者：趙軍（ 1973-）， 男， 漢族， 博士， 研究員，研究方向為中藥民族藥的研究與開發。E-mail： zhaojun21cn@163.com