響應面試驗優化超聲波輔助雙水相提取黑果枸杞原花青素工藝

郭杰 王瑞雪 郝楠 王吉鴻

[摘 要] ?應用單因素試驗和響應面法優化超聲波輔助雙水相提取黑果枸杞原花青素工藝，利用BBD模型對乙醇體積分數、硫酸銨質量濃度、料液比、超聲時間和超聲功率等提取參數進行了優化，選取最優條件。結果表明，超聲波輔助雙水相提取黑果枸杞原花青素最佳工藝條件在乙醇體積分數為61%，硫酸銨質量濃度為0.24 g/mL，料液比為1∶26，超聲時間為49 min，超聲功率為220 W的條件下，黑果枸杞原花青素提取率達到6.113%。

[關鍵詞] ?響應面法;超聲波;雙水相;黑果枸杞;原花青素

[中圖分類號] ?TQ 914.1 ?[文獻標志碼] A ?[文章編號] 1005-0310（2020）04-0085-08

Abstract： Single factor experiment and response surface methodology were used to optimize the ultrasonic assisted aqueous two-phase extraction of proanthocyanidins from Lycium ruthenicum Murr.. Five key factors including ethanol volume fraction， ammonium sulfate concentration， solid-liquid ratio， ultrasonic time， ultrasonic power were selected by one-factor-at-a-time experiments. The results showed that the optimum conditions of ultrasonic assisted aqueous two-phase extraction of Proanthocyanidins from Lycium ruthenicum Murr. were as follows： ultrasonic time for 49 min at 220 W ultrasonic power with 61% ethanol volume and 0.24 g/mL ammonium sulfate， the extraction yield of Proanthocyanidins from Lycium ruthenicum Murr. reached 6.113%.

Keywords： Response surface methodology; Ultrasonic; Aqueous two-phase extraction; Lycium ruthenicum Murr.; Proanthocyanidins

黑果枸杞（Lycium ruthenicum Murr.），茄科枸杞屬多年生灌木，我國西北荒漠地區多有分布，具有極強的耐鹽、耐旱、耐堿特性。因其果實中含有大量的原花青素、多糖、維生素等功能性成分[1]，具有多種有益的生物活性，被稱為植物中的“軟黃金”[2-3]。其原花青素的含量遠高于其他天然植物，清除自由基功效是維生素C的20倍、維生素E的50倍，是自然界最有效的天然抗氧化劑[4-6]。黑果枸杞作為提取原花青素的理想植物，具有廣闊的應用空間。

目前，原花青素的提取方法主要集中在有機溶劑提取法、超聲波輔助提取、生物酶輔助提取等方面[7]。雙水相萃取因其條件溫和、提取高效、操作簡單、活性損失小、無有機溶劑殘留等優點，已廣泛應用于各種蛋白質純化和抗生素提取[8-9]，但關于黑果枸杞原花青素的雙水相萃取工藝研究不多。本研究采用乙醇-無機鹽雙水相體系，用以克服傳統聚合物雙水相體系成本高、分離時間長、易乳化、難回收等缺點，并通過耦合超聲波提高原花青素的提取率，以期為黑果枸杞原花青素工業化提取提供理論技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑果枸杞購于蘭州市藥材市場，自然晾干，干燥密封保存;原花青素標準品購于如吉生物科技公司;無水乙醇、硫酸銨、香草醛、無水甲醇等購于天津精細化工有限公司，均為分析純。

1.2 儀器與設備

KQ-250DE超聲波清洗機：昆山超聲波儀器有限公司;UV-2700紫外分光光度計：日本島津儀器有限公司;5804R冷凍離心機：艾本德儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 原花青素標準曲線的繪制

以原花青素標準品為對照，采用香草醛-鹽酸法測定黑果枸杞提取物中原花青素的含量[10]。原花青素標準品甲醇溶解，分別配制0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL標準溶液。取各標準液1 mL依次加入6.0 mL質量濃度為40.0 mg/mL的香草醛-甲醇溶液和3 mL濃鹽酸，混合均勻40 ℃避光反應30 min，甲醇為空白對照，500 nm波長處測吸光值。

1.3.2 黑果枸杞花青素的提取

黑果枸杞粉碎后過40目篩，稱取1.0 g 黑果枸杞粉末于錐形瓶中，加入一定量的乙醇-硫酸銨，待形成雙水相體系后，放入超聲波清洗器中，在一定的超聲波條件下處理一定的時間，離心，收集上清液定容形成母液。

1.3.3 原花青素提取率的測定

準確移取母液1.0 mL按1.3.1方法測定，重復3 次，取平均值，并利用標準曲線的回歸方程，按式（1）計算。

黑果枸杞原花青素提取率：Y（mg/g）=C×V×dM×100%。

（1）式中，C為定容后樣液質量濃度（mg/mL）;V為待測液總體積（mL）;d為稀釋倍數;M為黑果枸杞樣品質量（g）。

1.3.4 單因素試驗

1.3.4.1 乙醇體積分數對黑果枸杞原花青素提取率的影響

準確稱取1 g黑果枸杞粉末5份，分別加入體積分數為30%、40%、50%、60%、70%的乙醇，在硫酸銨質量濃度為0.25 g/mL，料液比為1∶50，超聲功率為200 W，超聲時間為30 min條件下萃取，每次試驗重復3次，取平均值計算原花青素提取率。

1.3.4.2 硫酸銨質量濃度對黑果枸杞原花青素提取的影響

準確稱取1 g黑果枸杞粉5份，分別加入質量濃度為0.15、0.20、0.25、0.30、0.35 g/mL的硫酸銨，在乙醇體積分數為50%，料液比為1∶50，超聲功率為200 W，超聲時間為30 min條件下萃取，每次試驗重復3次，取平均值計算原花青素提取率。

1.3.4.3 料液比值對黑果枸杞原花青素提取的影響

準確稱取1 g黑果枸杞粉5份，分別設置料液比為1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30，在乙醇體積分數為50%，硫酸銨質量濃度為0.25 g/mL，超聲功率為200 W，超聲時間為30 min條件下萃取，每次試驗重復3次，取平均值計算原花青素提取率。

1.3.4.4 超聲功率對黑果枸杞原花青素提取的影響

準確稱取1 g黑果枸杞粉5份，分別設置超聲功率為80、120、160、200、240 W，在乙醇體積分數為50%，硫酸銨質量濃度為0.25 g/mL，料液比為1∶50，超聲時間為30 min條件下萃取，每次試驗重復3次，取平均值計算原花青素提取率。

1.3.4.5 超聲時間對黑果枸杞原花青素提取的影響

準確稱取1 g黑果枸杞粉5份，分別設置超聲時間為15、30、45、60、75、90 min，在乙醇體積分數為50%，硫酸銨質量濃度為0.25 g/mL，料液比為1∶50，超聲功率為200 W條件下萃取，每次試驗重復3次，取平均值計算原花青素提取率。

1.3.5 響應面試驗

基于單因素實驗的結果，確定了乙醇體積分數、硫酸銨質量濃度、料液比、超聲功率及超聲時間為工藝參數，以原花青素提取率為指標，利用Box-Behnken的中心組合試驗設計原理進行實驗設計，優化提取工藝，評價影響多糖得率因素的主效應、相互效應及因素的二次效應關系，實驗因素與水平設計見表1。

試驗數據利用完全二次多項式方程進行多元線性回歸擬合，計算原花青素提取率和各實驗因素之間的函數關系，見式（2）。Y=A0+3i=1AiXi+3i=1AiiXiXi+2i=13j=i+1AijXiX 。

（2）式中，Y為預測的響應值，即原花青素提取率;A0 是常數，Ai 是線性系數，Aii 是二次方系數，Aij 是交互作用回歸系數;Xi是自變量。

1.4 數據統計

所有數據均表示為平均值±標準差，運用GraphPad Prism 8.0繪制實驗數據相關圖片，采用SPSS 18.0和 Design-Expert 8.0 數據處理系統進行統計分析，P<0.05或P<0.01表示差異具有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 乙醇體積分數對黑果枸杞原花青素提取率的影響

由香草醛-鹽酸法測定黑果枸杞提取物中原花青素含量所得的回歸方程：Y=3.165 5X+0.026 5，相關系數R2=0.998 7。其中X為原花青素質量濃度，Y為樣液在500 nm波長處的吸光值，該曲線在0.1～0.5 mg/mL范圍內線性關系良好，適用于黑果枸杞提取液中原花青素質量濃度的計算。

乙醇體積分數對黑果枸杞原花青素提取率的影響見圖1。當乙醇體積分數小于60%時，黑果枸杞原花青素提取率隨著乙醇體積分數的升高呈現上升趨勢;當乙醇體積分數超過60%時，黑果枸杞原花青素提取率隨著乙醇體積分數的升高呈現下降趨勢。這是因為原花青素溶于乙醇體系，所以開始隨著溶劑乙醇體積分數的增高而上升，而乙醇體積分數過高時會引起黑果枸杞中的醇溶性物質沉淀，從而導致共沉淀現象[11]，上相中原花青素含量降低。因此，乙醇體積分數為60%時為最佳提取參數。

2.1.2 硫酸銨質量濃度對黑果枸杞原花青素提取的影響

圖2表示硫酸銨質量濃度對黑果枸杞原花青素提取的影響，當硫酸銨質量濃度在0.15～0.25 g/mL范圍時，原花青素提取率隨硫酸銨質量濃度增大而增加，當達到0.25 g/mL時，原花青素提取率達到最高，而后，硫酸銨質量濃度再增加，原花青素提取率降低。開始時隨硫酸銨用量的增加會增強雙水相析相作用，提高原花青素的提取率，當硫酸銨質量濃度過高時，無機鹽相增大而有機相減小，從而降低溶解于有機相中的原花青素含量[12]。因此，選硫酸銨質量濃度為0.25 g/mL為最佳的提取參數。

2.1.3 料液比值對黑果枸杞原花青素提取的影響

料液比對原花青素提取率的影響如圖3所示，料液比在1∶10到1∶25的范圍內，原花青素提取率隨料液比的升高而增加，此后繼續增加料液比，原花青素提取率不再增高。在一定范圍內，溶質和溶液的接觸面積隨著料液比的增加而擴大，有利于原花青素的溶出[13];但料液比超過1∶25之后，細胞內外的原花青素已經達到了溶解平衡，已被充分浸提出來，考慮到提取成本，料液比選擇1∶25作為原花青素提取的最佳提取參數。

2.1.4 超聲功率對黑果枸杞原花青素提取的影響

在乙醇體積分數為50%，硫酸銨質量濃度為0.25 g/mL，料液比為1∶50，超聲時間為30 min條件下考察超聲功率對黑果枸杞原花青素提取的影響（圖4）。超聲功率在80 W到200 W的范圍內，原花青素提取率隨超聲功率的升高而增加，此后繼續增加超聲功率，原花青素提取率增高不明顯，考慮到提取成本，超聲功率為200 W作為原花青素提取的最佳提取參數。

2.1.5 超聲時間對黑果枸杞原花青素提取的影響

超聲時間對原花青素提取率的影響見圖5，提取時間在20～45 min范圍內，原花青素提取率隨提取時間的延長增加迅速;提取時間超過45 min以后增加趨勢不明顯且略有下降。其原因可能是原花青素中的羥基容易被氧化，隨著提取時間延長，部分原花青素氧化分解[14]，所以在超過45 min后原花青素提取率會略有所下降。因此，選45 min為黑果枸杞原花青素最佳的提取時間。

回歸模型的擬合極顯著（P<0.000 1），實驗復相關系數（R2）是0.891 8和校正測定系數（R2adj）是0.805 2，以上結果均表明模型擬合程度高可靠性強，觀察值和預測值之間的相關性良好，在實驗變量范圍內具有很高的顯著性，可用該模型來分析和預測原花青素的提取條件，此外，低變異系數（cv）為7.11%表示模型的精度高。以上分析結果證實選用的試驗方法準確可靠，可以用此回歸方程對試驗結果進行分析和預測。表3的結果顯示模型的一次項E極顯著，D顯著;二次項A2，B2，C2， E2極顯著。所選的各因素水平范圍內，超聲功率對原花青素提取率的影響最為顯著。

根據多元回歸方程做出不同處理因素對黑果枸杞原花青素提取率的影響相應的三維響應面和二維等高線如圖6、圖7所示。三維響應面闡釋了當其他因素保持在零水平不變時，因變量之間的關系和兩個測試變量之間的相互作用[15]，二維等高線圖的形狀反映了變量之間的交互效應，圓圖表示試驗參數相互作用影響不顯著，而橢圓輪廓圖表示試驗參數相互作用影響顯著[16-17]。由圖6（a）、圖7（a）觀察可知，乙醇體積分數和硫酸銨質量濃度交互作用顯著，硫酸銨質量濃度軸向等高線密集且變化趨勢陡峭，乙醇體積分數軸向等高線較稀疏且變化平緩，表明硫酸銨質量濃度比乙醇體積分數對原花青素提取率的影響顯著;圖6（b）、6（c）、6（f）和6（h）結果表明，乙醇體積分數與料液比、乙醇體積分數與超聲時間、硫酸銨質量濃度與超聲時間、料液比與超聲時間交互作用不顯著;但從整體二維等高線圖曲面的變化趨勢分析，超聲功率顯著影響花青素提取率，這一結果與方差分析結果一致。

2.2.2 最優工藝條件及驗證實驗

利用Design-Expert 8.0軟件分析優化黑果枸杞原花青素提取的最佳條件：乙醇體積分數為61.2%，硫酸銨質量濃度為0.243 5 g/mL，料液比為1∶25.85，超聲時間為48.58 min，超聲功率為215.6 W。最佳條件下黑果枸杞原花青素預測最高提取率為6.147 7%。為檢驗預測結果的可靠性，兼顧實際操作的便利性，將上述最佳提取條件修正為乙醇體積分數為61%，硫酸銨質量濃度為0.24 g/mL，料液比為1∶26，超聲時間為49 min，超聲功率為220 W進行重復實驗。3次平行試驗實際測得黑果枸杞原花青素提取率為6.113±0.142%，證實了預測值和實驗值之間的良好相關性，表明該模型適用于黑果枸杞原花青素的提取。

3 結束語

本研究利用響應面法優化超聲波輔助雙水相提取黑果枸杞原花青素的工藝參數，在乙醇體積分數為61%，硫酸銨質量濃度為0.24 g/mL，料液比為1∶26，超聲時間為49 min，超聲功率為220 W的條件下，黑果枸杞原花青素提取率達到6.113%，而趙文娟等人應用傳統醇提工藝提取黑果枸杞原花青素提取率為4.315%[18]，本研究方法明顯高于趙文娟等人的提取工藝。以上結果表明超聲波輔助雙水相法是一種可靠高效的原花青素提取方法。

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（責任編輯 ?李亞青）