重組人血管內皮抑制素抑制P 糖蛋白表達對晚期非小細胞肺癌耐藥性的影響△

程少先，譚詩云

華中科技大學協和京山醫院1胸外科，2神經內科，湖北 京山 431800

肺癌是當今人類發病率最高的惡性腫瘤，居腫瘤死因第一位，給世界帶來了沉重的經濟負擔[1]。非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）占肺癌的85%，其標準治療方案是手術切除和術后放化療，目前NSCLC患者術后化療的有效率為30%～40%，并且大約有一半的NSCLC患者初次發現時已是中晚期（Ⅲ期及以上），無法進行手術切除，因此化療在肺癌患者尤其是中晚期患者中起到關鍵作用[2]。但是由于經驗性用藥[3-5]和化療過程中腫瘤細胞產生的多藥耐藥性（multidrug resistance，MDR）[6]，化療效果往往并不顯著。MDR的產生最根本的原因之一是細胞膜表面P糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）轉運體過表達[7]。國外諸多的研究結果顯示，藥敏實驗可作為研究腫瘤化療臨床療效的有效方式，且腫瘤細胞體外化療藥敏實驗結果與體內化療療效符合率高達80%以上[8-10]。目前，對于奈達鉑和重組人血管內皮抑制素的體外耐藥實驗研究較少，有待于進一步研究。本研究回顧性分析92例NSCLC合并惡性胸腔積液患者的臨床資料，應用MTT藥敏實驗檢測重組人血管內皮抑制素聯合奈達鉑作用后肺組織中淋巴細胞P-gp陽性表達率，探討重組人血管內皮抑制素聯合奈達鉑治療NSCLC對耐藥性的影響，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2016年11月至2019年11月華中科技大學協和京山醫院收治的NSCLC合并惡性胸腔積液患者的病歷資料。納入標準：①病理組織學或活檢確診為NSCLC，臨床分期為ⅢB～Ⅳ期；②彩超及X線檢查確診為惡性胸腔積液；③未發現根治性手術指征且生存期＞3個月。排除標準：①合并心功能異?；蚋文I功能障礙；②合并免疫性疾病、凝血功能障礙及全身感染性疾??；③有化療禁忌證；④存在嚴重肺部疾病病史或既往有化療史；⑤納入研究前1個月有手術史或外傷史；⑥腫瘤細胞已侵襲重要血管或發生中樞神經系統轉移。根據納入、排除標準，共納入92例NSCLC合并惡性胸腔積液患者，其中男性45例，女性47例，中位年齡56.43歲，所有患者收治前均經過3～6個療程的全身化療。收集92例患者無變性、無壞死的新鮮NSCLC組織，分為對照組與觀察組，每組46例。

1.2 儀器與試劑

FACScan型流式細胞檢測儀購自美國Becton Dickinson公司；P-gp試劑與試劑盒均購自法國國際免疫公司。

1.3 實驗方法

對照組予奈達鉑培養48 h，觀察組予奈達鉑培養24 h后繼續重組人血管內皮抑制素注射液培養24 h。比較兩組患者處理前后的P-gp表達情況。抗癌藥物濃度根據臨床化療用藥劑量，按下列公式計算：實驗用藥物濃度 P（mg/L）=50×D/5000÷50%×103[D為臨床用藥劑量（mg·kg-1·d-1）]。

應用FACScan型流式細胞檢測儀對兩組患者的淋巴細胞標本進行檢測（每份標本收集20 000個淋巴細胞），應用Cell Ques Plot軟件在Macintosh 650型電腦上進行數據分析。P-gp的含量以P-gp陽性細胞所占百分比表示，P-gp含量=陽性細胞數/（陽性細胞數+陰性細胞數）-非特異性結合細胞；P-gp陽性界值通過對患者外周血淋巴細胞膜P-gp含量的測定進行結算，測定患者外周血淋巴細胞膜P-gp含量后取95%可信區間上限，即均值+2×標準差為陽性的界值，大于該陽性界值可判定為P-gp表達陽性，小于或者等于該陽性界值可判定為P-gp表達陰性。

1.4 統計學方法

采用SPSS 19.0統計軟件進行分析，計數資料以例數及率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

治療前，兩組患者P-gp陽性表達率比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。治療后，觀察組患者P-gp陽性表達率下降，對照組P-gp陽性表達率上升，且觀察組患者P-gp陽性表達率低于對照組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。（表1）

表1 治療前后兩組患者P-gp陽性表達率的比較

3 討論

在中國肺癌已經成為威脅人民健康和生活質量最主要的惡性腫瘤，其5年生存率約為10%，影響肺癌患者生存率的主要因素是MDR導致的化療失敗。惡性腫瘤的耐藥機制通常較為復雜，目前國內外對于惡性腫瘤耐藥機制的研究較多，尤其是與P-gp相關的研究[11]。于云莉等[12]指出P-gp屬于能量依賴性外排泵，能夠將親脂型藥物泵出細胞外。有學者在研究中指出，當藥物進入細胞之后，P-gp作為MDR1編碼的細胞膜糖蛋白會與藥物分子結合，同時P-gp的ATP位點會在結合ATP之后釋放出能量使藥物轉移到細胞外，進而導致細胞內藥物濃度始終保持在低水平，造成耐藥性的產生[13-14]。本研究顯示入組標本治療前已經有較高的P-gp陽性表達率，并且兩組比較差異無統計學意義，這說明NSCLC合并胸腔積液患者MDR具有普遍性，這也反映了肺癌患者總體5年生存率低的原因。

Huang等[15]亦指出，P-gp除了能夠以能量依賴性的方式將藥物泵出細胞外，減少藥物進入細胞的概率和細胞內積蓄藥物的量，還能夠讓細胞內藥物再分布，起到減少作用靶點部位藥物濃度的作用。因此，NSCLC患者肺癌組織中P-gp的陽性表達能夠促進NSCLC組織耐藥性的形成，除此之外，P-gp還能夠通過對凋亡關鍵酶的抑制作用直接抑制細胞的凋亡，但P-gp和信號分子之間的關系較為復雜，其確切的耐藥機制尚有待于進一步研究[16]。

重組人血管內皮抑制素能夠通過阻斷血管內皮生長因子受體促進血管內皮細胞凋亡，抑制血管內皮細胞增殖，降低腫瘤轉移的效率[17]。相關的基礎研究顯示，重組人血管內皮抑制素能夠通過下調血管內皮生長因子的分泌，抑制血管內皮生長因子的活性，從而抑制腫瘤淋巴管及血管的生成，降低腫瘤血管的通透性，減少胸腔積液的生成[18]。在重組人血管內皮抑制素的抗腫瘤機制方面，Liang等[19]的研究指出，重組人血管內皮抑制素可以通過促血管生成因子和抗血管生成因子之間平衡的重建實現對腫瘤血管正?；恼T導，起到抗腫瘤的作用。近年來國外諸多的研究者致力于通過抑制血管內皮生長因子與血管內皮生長因子受體的結合抑制新生血管的生成，進而實現抑制腫瘤生長的目的[20-21]。抗新生血管生成藥物和化療藥物協同作用能夠阻斷腫瘤的營養供給，降低腫瘤復發、轉移的可能。由于血管內皮細胞具有遺傳上的穩定性，因此在應用重組人血管內皮抑制素治療惡性腫瘤時不易獲得耐藥性。但由于該類藥物具有非細胞毒性和靶向性等特點，主要對腫瘤細胞起到穩定和調控的作用，不容易達到最大耐受劑量，因此通常在臨床中與常規的放化療聯合應用或序貫應用。本研究中觀察組聯合應用奈達鉑和重組人血管內皮抑制素后P-gp陽性表達率下降。

董米連等[22]研究顯示外周血淋巴細胞可以代替大腸癌細胞進行體外藥敏實驗。覃理靈等[23]利用肝癌患者淋巴細胞與腫瘤細胞進行化療藥物敏感測定顯示，肝癌患者淋巴細胞化療藥敏檢測對不可切除的肝癌選擇化療藥物具有重要參考價值。由于本研究所選病例均為晚期患者，標本量有限，其研究P-gp陽性界值是通過對患者外周血淋巴細胞膜P-gp含量的測定進行結算，所以選擇淋巴細胞進行P-gp蛋白測定而不是選擇腫瘤細胞測定，結果顯示淋巴細胞代替腫瘤細胞進行體外藥敏實驗是可行的。

本研究應用MTT藥敏實驗對NSCLC患者不同個體進行化療藥物篩選可以幫助患者克服耐藥性，提高生存率，有著重要的研究價值，對于NSCLC合并惡性胸腔積液患者的藥物選擇和個性化治療有著重要的意義。