真武湯治療新型冠狀病毒感染的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究：基于五運六氣理論

朱紅俊，陸 曙

(南京中醫(yī)藥大學(xué)無錫附屬醫(yī)院 心血管科，江蘇 無錫 214071)

新型冠狀病毒(COVID-19)是一種全新的病毒，目前我們對其認識還不足，但COVID-19具有傳染性強、傳播速度快等特點，屬于中醫(yī)瘟疫的范疇。幾千年來，中醫(yī)藥在防治瘟疫方面積累了豐富的經(jīng)驗，并形成了獨特的理論體系，五運六氣理論是其中最重要的理論之一。

在五運六氣理論中，世界由五種穩(wěn)定的勢態(tài)和六種變化的時態(tài)構(gòu)成[1]。五種勢態(tài)包括木、火、土、金、水五運；六種時態(tài)包括太陽、少陽、陽明、厥陰、少陰、太陰六氣。

根據(jù)五運六氣理論，筆者認為COVID-19病毒感染屬于土運的勢態(tài)不足；時態(tài)變化則是從太陽和少陰開始，在這個階段得到扭轉(zhuǎn)疾病就會好轉(zhuǎn)，否則，疾病就會迅速進展到太陰時態(tài)，發(fā)展成COVID-19肺炎以及危重狀態(tài)。針對這種疾病特點，中醫(yī)經(jīng)典書籍《傷寒論》中的真武湯可以有效治療。

中國中醫(yī)科學(xué)院仝小林院士認為本病特點屬于“寒濕”，這也是真武湯的適應(yīng)證。國家中醫(yī)藥管理局《關(guān)于推薦在中西醫(yī)結(jié)合救治新型冠狀病毒感染的肺炎中使用“清肺排毒湯”的通知》(國中醫(yī)藥辦醫(yī)政函[2020]22號)中推薦的清肺排毒湯臨床治療COVID-19感染效果很好，其處方也含有真武湯5種草藥中的3種：白術(shù)、茯苓、生姜。

本研究基于五運六氣理論，通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析，探討真武湯與COVID-19肺炎在有效成分、作用靶點及通路等方面的聯(lián)系，探索其潛在的作用機制，為中醫(yī)藥治療COVID-19提供一定的理論基礎(chǔ)與科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 真武湯相關(guān)靶點篩選

通過計算系統(tǒng)生物學(xué)實驗室[2](https：//tcmspw.com/)檢索真武湯中5味中草藥附子、白術(shù)、白芍、茯苓、生姜作用的蛋白質(zhì)靶點，并在Uniprot蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(https：//www.uniprot.org)，對蛋白質(zhì)靶點進行規(guī)范。

1.2 COVID-19肺炎相關(guān)靶點預(yù)測篩選

以“pneumonia”為疾病關(guān)鍵詞，在GeneCards數(shù)據(jù)庫(https：//www.genecards.org)中進行數(shù)據(jù)挖掘，得到與COVID-19肺炎相關(guān)的靶點。

1.3 真武湯成分-靶點PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

利用Venny2.1.0工具取藥物靶點與疾病靶點的交集，并將交集靶點提交至String11.0 數(shù)據(jù)庫(https：//string-db.org)構(gòu)建蛋白互作(PPI)網(wǎng)絡(luò)[3]。生物種類設(shè)定為“Homo sapiens”，參數(shù)設(shè)定為默認設(shè)置，并通過MCL聚類分析挖掘核心蛋白組團。

1.4 真武湯-COVID-19肺炎交集靶點功能與通路富集分析

采用David6.8對真武湯化學(xué)成分靶點與COVID-19肺炎靶點的交集的靶點進行GO 富集分析，分析生物學(xué)過程；利用KEGG 通路分析，分析代謝通路，并進行蛋白功能區(qū)域分析。保存數(shù)據(jù)結(jié)果，以P<0.01進行篩選。

1.5 真武湯藥物成分-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建

檢索真武湯中5味草藥的全部化學(xué)成分，挖掘所有化學(xué)成分的相關(guān)靶點，與47個交集靶點相比對，篩選出作用于47個交集靶點相關(guān)的化學(xué)分子。

運用Cytoscape3.7.2構(gòu)建真武湯成分-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)圖，利用Cytoscape3.7.2內(nèi)置工具分析有效成分及靶點的網(wǎng)絡(luò)連接度(Degree)，并根據(jù)Degree參數(shù)判斷核心靶點及發(fā)揮藥效的主要活性成分。

2 結(jié)果

2.1 真武湯中草藥靶點的數(shù)據(jù)挖掘

經(jīng)檢索得到附子作用靶點68個、白術(shù)作用靶點259個、白芍作用靶點646個、茯苓作用靶點69個，生姜作用靶點685個，合計1 727個，刪除重復(fù)值后真武湯中5種草藥的作用靶點總計778個。

2.2 COVID-19肺炎相關(guān)靶點的數(shù)據(jù)挖掘

COVID-19肺炎相關(guān)靶點合計檢索到4 473個。采用Venny 2.1工具取真武湯草藥靶點和COVID-19肺炎相關(guān)靶點的交集，得到交集靶點47個(見表1)。

2.3 交集靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將篩選得到的47種藥物-疾病交集靶點上傳到String11.0平臺，構(gòu)建得到PPI網(wǎng)絡(luò)(見圖1)?？梢园l(fā)現(xiàn)PNMT(苯乙醇胺N-甲基轉(zhuǎn)移酶)、HDAC8 (組蛋白脫乙酰酶8)游離于網(wǎng)絡(luò)之外，與其他蛋白沒有相互作用。通過MCL聚類分析，提取了以GAPDH、CAT和HMOX1、TNF和ICAM1為中心的3個核心蛋白質(zhì)功能團。

2.4 靶點功能與通路的富集分析

采用David6.8進行47個交集靶點功能與通路的富集分析，并以P<0.01進行篩選。GO富集分析得出107個生物學(xué)過程，其中P<0.01的生物學(xué)過程有30個；KEGG通路富集分析得出62個靶點通路(P<0.01)。蛋白功能區(qū)域SMART分析顯示，交集靶點主要作用在ZnF_C4、HOLI、S_TKc、PAC、LH2五個蛋白功能區(qū)域。表2、表3、表4分別列舉出了前10個功能、通路和5個蛋白域。

表1 真武湯草藥和COVID-19肺炎相關(guān)靶點的交集靶點

2.5 真武湯成分-COVID-19肺炎相關(guān)靶點-通路網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建

經(jīng)檢索并去除不同草藥中的重復(fù)成分，總計檢索出真武湯300種不同化學(xué)分子成分。檢索出300種分子的所有靶點，與真武湯-疾病交集靶點進行比對，篩選出與47個靶點相關(guān)聯(lián)的真武湯化學(xué)分子共計95種。采用Cytoscape3.7.2軟件構(gòu)建真武湯-中藥-分子-靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建(見圖2)，以軟件自帶的工具進行網(wǎng)絡(luò)分析，根據(jù)Degree值進行排序。

分析結(jié)果顯示，真武湯5種中草藥中，生姜、白芍在網(wǎng)絡(luò)中的重要性較高；47個靶點中，溶菌酶、孕激素受體、組織蛋白酶D、腫瘤壞死因子、鉀電壓門控通道亞科H-2在網(wǎng)絡(luò)中重要性較高；95種化學(xué)分子中，醋酸、山柰酚、水楊酸、棕櫚酸、甘氨酸的重要性較高。表5、表6、表7分別列出了5種中藥排序、前10位的化學(xué)分子和靶點的排序。

表2 Go分析前10位交集靶點相關(guān)生物學(xué)過程

表3 KEGG分析前10位交集靶點相關(guān)通路

表4 交集靶點的蛋白域

圖1 真武湯-COVID-19肺炎交集靶點PPI網(wǎng)絡(luò)

圖2 真武湯-中藥-分子-靶點網(wǎng)絡(luò)

表5 真武湯草藥Degree值排序

表6 交集靶點關(guān)聯(lián)的真武湯化學(xué)分子Degree值前10位

表7 真武湯和COVID-19肺炎交集靶點Degree值前10位

根據(jù)分析數(shù)據(jù)，采用真武湯5味草藥的排序前10個化學(xué)分子，以及排序前10位基因靶點、生物學(xué)過程及信號通路，重新構(gòu)建真武湯-中藥-分子-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)(見圖3)。

如圖3可見，排序靠前的10靶點只能涵蓋前6個生物學(xué)過程，但可以涵蓋前10個通路。其中，TNF最為關(guān)鍵。TNF細胞因子是由巨噬細胞分泌的一種小分子蛋白，可能和COVID-19感染的炎癥反應(yīng)有關(guān)。通過KEEG BRITE查詢得到TNF信號通路機制(見圖4)。圖4中可見：TNF有TNFR1、TNFR2的2個信號通路環(huán)節(jié)。其中MAPK信號通路參與了TNFR1介導(dǎo)的信號傳遞過程。而真武湯-COVID-19肺炎47個交集靶點中包含了MAPK信號通路中的5個靶點：MAPK1、MAPK3、MAPK8、MAPK10、MAPK14。這提示，真武湯是作用于TNFR1介導(dǎo)的TNF信號通路。

圖3 真武湯-中藥-分子-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)

圖4 TNF信號通路

3 討論

3.1 真武湯治療COVID-19肺炎的五運六氣理論分析

新型冠狀病毒(COVID-19)可能起源于蝙蝠，發(fā)生跨界侵襲感染人類的具體時間尚不清楚，但出現(xiàn)臨床癥狀而被發(fā)現(xiàn)、報道的時間在2019年年底，也就是主氣的六之氣太陽寒水階段。

2019是己亥之年，土運不及，厥陰司天，相火在泉?！端貑枴ちo大論》云：“凡此厥陰司天之政，氣化運行后天……天氣擾，地氣正，風(fēng)生高遠，炎熱從之，云趨雨府，濕化乃行?！苯?jīng)義符合新型冠狀病毒感染濕象明顯的特點。2019年六之氣時，主氣太陽寒水、客氣少陽相火。太陽寒水人體陽氣潛藏，但客氣少陽相火其性為陽，與人體的陽氣兩氣相感，導(dǎo)致浮陽游離，少陰腎氣有隙，邪氣中人及入，逆沖于太陰，與濕氣交渾，故濕、熱皆本為時之常氣，濕為太陰，熱為浮陽。因此，臨床見苔膩而熱不高，但邪蘊于其中而為患，故濕為象，邪為本。

因此，從運氣學(xué)來分析，新型冠狀病毒感染是太陽少陰兩感于邪，上逆于太陰肺經(jīng)。臨床根據(jù)不同時機與臨床疾病之病象選擇麻黃附子細辛湯、真武湯等是可行性的方案。

3.2 真武湯治療COVID-19肺炎的病理及運氣理論分析

COVID-19肺炎危重癥導(dǎo)致死亡的原因很多，但直接的原因是缺氧。病理研究結(jié)果顯示，患者肺泡被黏液所覆蓋，氣體交換功能喪失，類似溺水[4]。從中醫(yī)角度講，這是氣機的升降出入出現(xiàn)了嚴重問題，孤陽不生，缺氧一旦出現(xiàn)，全身臟器都會衰竭，心、腦、腎首當(dāng)其沖。肺傷，大氣孤絕；腦傷，神游在外；心傷，寒飲上逆陽氣外絕，腎傷，關(guān)格窿閉三焦不通。無論哪一種，預(yù)后均極差，死亡迅速。

治療的首要是祛邪。邪為疫毒，其性難了，但邪不空見，必依附于正氣，隨氣升浮，氣出邪去。濕為標(biāo)，邪為本，濕去邪出，治濕不利小便非其治也。不論國家診療方案中的五苓散，還是臨床廣泛運用的三仁湯、銀翹散、甘露消毒丹、藿樸夏苓湯等，臨床均有效驗。諸方中也均有淡滲利濕、甘淡去濕等藥物。目的在于利濕導(dǎo)邪，而非只為祛濕。

病理分析結(jié)果表明，本病危險在肺泡阻隔，技術(shù)上可能及時進行肺灌洗可提高成功率。但這對于醫(yī)務(wù)人員的風(fēng)險較大。ECMO理論上可幫助搶奪搶救時間，但盡早獲得ECMO支持較難。因此，盡早進行中醫(yī)干預(yù)非常重要。

對30例醫(yī)務(wù)人員感染癥狀的分析顯示：感染COVID-19病毒后，咳嗽占83.33%、發(fā)燒占76.67%、疲勞占70%，其他癥狀還有頭痛、惡心、嘔吐或腹瀉、呼吸困難等[5]。在發(fā)熱、干咳、乏力這三大主癥中，核心在干咳，發(fā)熱反而不是最關(guān)鍵的癥狀。干咳不好，熱退也作用有限。當(dāng)然，熱退提示炎癥反應(yīng)降低，有一定意義。乏力是宗氣大衰的表現(xiàn)，是機體缺氧的結(jié)果，因此，不能到氧飽和度下降才干預(yù)，有乏力就應(yīng)當(dāng)及時氧療。

臨床見到干咳應(yīng)積極干預(yù)阻斷，也許可以大大增加獲救的機會，這是疾病規(guī)律決定的。中藥處方中合用淡滲或甘淡之品，也許可以減輕肺泡水腫炎癥滲出的可能。

大疫當(dāng)前，臨床有出現(xiàn)特效方劑的可能，但疾病的復(fù)雜性也決定了依靠一方一藥防治COVID-19肺炎是有難度的，目前臨床有效的經(jīng)驗也沒有局限在一個方藥上。但臨床處方應(yīng)當(dāng)有主線，有核心處方。

COVID-19肺炎疾病的發(fā)展過程清晰展示了太陽外感(感毒)、內(nèi)陷少陰(免疫反應(yīng))、上逆于太陰(肺炎)的過程。因此，以真武湯為核心，配伍三甲散分消主客、射干麻黃湯治療咳嗽、麻杏石甘湯治療發(fā)熱、五苓散導(dǎo)利濕邪等。當(dāng)然，以銀翹散替換麻杏石甘湯、三仁湯、藿樸夏苓湯、澤漆湯等替換五苓散均可行。輕癥也可以不用三甲散，但難治干咳或有內(nèi)陷跡象的須用。主客交渾，不能分消主客則邪毒難去。

3.3 真武湯治療COVID-19肺炎的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

如前文所言，真武湯可以作為治療COVID-19肺炎的核心處方。但這除了理論和臨床分析外，還需有現(xiàn)代機制的支持。

本文經(jīng)過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析顯示：盡管臨床普遍將真武湯歸入附子類方，但真武湯中起主要作用的草藥是生姜、白芍、白術(shù)，而不是附子。真武湯主要化學(xué)分子是醋酸、山柰酚、水楊酸、棕櫚酸、甘氨酸、谷甾醇等；主要作用靶點是溶菌酶、孕激素受體、組織蛋白酶D、腫瘤壞死因子、鉀電壓門控通道亞科H-2等。核心蛋白質(zhì)功能團分別以GAPDH、CAT和HMOX1、TNF和ICAM1為中心，蛋白功能區(qū)域集中在ZnF_C4、HOLI、S_TKc、PAC、LH2等，主要生物學(xué)過程為序列特異性DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性的調(diào)控、MAPK活性的激活、過氧化氫分解代謝過程、環(huán)化酶活性的正調(diào)控、上皮細胞分化等。主要干預(yù)的通路包括2型糖尿病、NOD樣受體信號通路、腫瘤壞死因子信號通路、弓形體病、Fc-εRI信號通路、甲型流感等。

這個研究結(jié)果顯示了真武湯干預(yù)COVID-19肺炎的機制，也提示了COVID-19肺炎這個新型疾病的部分臨床現(xiàn)象的機理。

2型糖尿病相關(guān)通路與COVID-19肺炎高度相關(guān)。這提示糖尿病患者是COVID-19病毒的易感人群，而真武湯可以調(diào)節(jié)胰島素受體，提高糖尿病人群的抗COVID-19感染能力。

目前認為，COVID-19病毒主要是通過血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE-2)建立對人體的攻擊路徑。具有ACE-2表達的肺細胞可能是COVID-19感染期間的主要靶細胞[6]。不能忽視的是，ACE-2在體內(nèi)分布以心、腎最多，其次是腸和肺，而COVID-19病毒感染卻以肺炎為最嚴重、最突出的表現(xiàn)。因此，ACE-2介導(dǎo)途徑之外可能存在其他機制，這是一個合理的推測。目前認為FURIN[7]、GRP78[8]和CD147[9]也與COVID-19病毒感染途徑有關(guān)，其中，F(xiàn)URIN在GeneCards數(shù)據(jù)庫可以檢索到，也在本文檢索結(jié)果中，但不在交集靶點中。

此外，ACE-2在心、腎分布較多，但COVID-19病毒感染后肺部損傷更為突出。考慮到肺部與心、腎不同的氣體接觸環(huán)境，這個差異是否與過氧化氫酶、髓過氧化氫酶、過氧化物酶體增殖體激活受體等過氧化反應(yīng)有關(guān)，也是值得關(guān)注和研究的方向。

對于不同人群COVID-19病毒易感性的研究認為，相對于女性，男性更容易感染COVID-19病毒。對30例感染COVID-19病毒的醫(yī)務(wù)人員分析顯示，男女感染比例為2∶1[5]。目前認為，這可能與ACE-2受體男女分布差異有關(guān)。本文結(jié)果顯示，孕激素受體、雄性激素受體和COVID-19肺炎相關(guān)，也許提示了COVID-19病毒感染性別分布差異的其他機制。

上述分析結(jié)果與蛋白組團的解析結(jié)果也一致。GAPDH核心蛋白功能團包括了AR、INSR，這提示了糖尿病、性別是易感因素。CAT-HMOX1核心蛋白功能團與過氧化機制相關(guān)，這提示了肺組織易感性。TNF-ICAM1核心蛋白功能團則提示了炎癥反應(yīng)的中心機制。

蛋白功能區(qū)域的分析顯示，真武湯治療COVID-19病毒感染的機制與ZnF_C4、HOLI、S_TKc、PAC、LH2五個蛋白功能區(qū)域有關(guān)。其中，ZnF_C4是核激素受體中的C4鋅指。鋅指(Znf)結(jié)構(gòu)域是一種相對較小的蛋白基序，它包含多個指狀突起，與靶分子相互串聯(lián)。其中一些結(jié)構(gòu)域與鋅結(jié)合，具有多種RNA識別模式[10]。目前臨床治療COVID-19病毒感染的治療方案中，韓國方案包含了鋅劑治療，臨床有效，推測其機制可能與ZnF_C4蛋白功能區(qū)域有關(guān)。真武湯具有相似的效果。

至于鉀電壓門控通道亞科H-2也許與重癥COVID-19肺炎猝死有關(guān)。

此外，本文分析結(jié)果也許可以提供一些預(yù)防COVID-19病毒感染的生活建議。本文結(jié)果顯示，真武湯有效藥物中生姜排序位列第一；有效分子中醋酸、水楊酸、甘氨酸排序靠前；鋅指是關(guān)鍵蛋白功能區(qū)域。因此，生姜、食醋以及含甘氨酸、含鋅的保健食品也許可以作為預(yù)防COVID-19病毒感染的食療方法。但這應(yīng)該理性看待，過猶不及，適量就好。

綜上所述，在五運六氣理論指導(dǎo)下，選擇真武湯治療新型冠狀病毒感染及相關(guān)肺炎具有理論基礎(chǔ)與科學(xué)依據(jù)，對當(dāng)前疫情防控具有一定價值。