結(jié)核分枝桿菌耐藥基因芯片檢測(cè)在復(fù)治肺結(jié)核患者中的應(yīng)用價(jià)值

施伎蟬 何貴清 寧洪葉 吳聯(lián)朋 吳正興 劉賽朵 葉新春 潘寧 蔣賢高

近年來(lái)，流動(dòng)人口的增加、診治的延誤和不規(guī)范治療、患者依從性低等原因?qū)е履退幘甑脑黾樱斐赡投嗨幗Y(jié)核病（multidrug-resistant tuberculosis，MDR-TB）的流行[1]。2017年世界衛(wèi)生組織估算我國(guó)2016年新發(fā)病例89.5萬(wàn)，耐多藥/單耐利福平（multidrug-resistant or rifampicin-resistant，MDR/RR）患者 5.8 萬(wàn)[2]，而復(fù)治肺結(jié)核（re-treatment tuberculosis）中 MDR/RR-TB患者比例達(dá)到24%，遠(yuǎn)高于初治肺結(jié)核（primary tuberculosis，TB）中MDR/RR-TB7.1%的比例，且復(fù)治肺結(jié)核治療成功后也有部分再次復(fù)發(fā)[3]。復(fù)治患者藥物暴露的時(shí)間越長(zhǎng)，藥物治療的敏感性會(huì)越低[4]，并發(fā)其他疾病日益增多[5]，多種因素的影響導(dǎo)致復(fù)治肺結(jié)核的治愈率僅有60%左右[6]。因此快速檢測(cè)復(fù)治肺結(jié)核患者的耐藥性、及時(shí)準(zhǔn)確提供有效的治療，對(duì)結(jié)核病疫情的控制均至關(guān)重要。本研究以BACTEC MGIT 960耐藥性檢測(cè)結(jié)果為金指標(biāo)，將161例復(fù)治肺結(jié)核患者感染菌株分別進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌（MTB）耐藥基因芯片檢測(cè)及BACTEC MGIT 960耐藥性檢測(cè)，將結(jié)果進(jìn)行比對(duì)分析，旨在探討耐藥基因芯片檢測(cè)技術(shù)在復(fù)治肺結(jié)核患者中的臨床應(yīng)用價(jià)值。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 收集本院2017年1月至2018年12月門(mén)診和住院復(fù)治肺結(jié)核患者161例，男102例，女59例，年齡29～68（49.0±18.5）歲。復(fù)治肺結(jié)核的診斷標(biāo)準(zhǔn)參照《WS 196-2017結(jié)核病分類(lèi)》衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)[7]，有下列情況之一者為復(fù)治：（1）因結(jié)核病不合理或不規(guī)則服用抗結(jié)核藥物治療≥1個(gè)月的患者；（2）初治失敗或復(fù)發(fā)的患者。同時(shí)經(jīng)菌型鑒定排除非結(jié)核分枝桿菌3例。本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理批準(zhǔn)，所有患者已簽署知情同意。

1.2 標(biāo)本采集 161例患者各留取痰標(biāo)本各2份，門(mén)診患者留取即時(shí)痰（就診當(dāng)時(shí)咳出的痰），住院患者留取清晨痰（起床后深咳吐出的痰）。均分別送檢BACTEC MGIT 960系統(tǒng)結(jié)核菌液體培養(yǎng)+藥敏試驗(yàn)、MTB耐藥基因芯片檢測(cè)。質(zhì)控菌株為H37Rv（ATCC27294）標(biāo)準(zhǔn)株，由國(guó)家結(jié)核參比實(shí)驗(yàn)室提供。

1.3 試劑與儀器 MTB耐藥基因芯片試劑盒由亞能生物技術(shù)有限公司提供；朗基L96+/Y型PCR儀/基因擴(kuò)增儀，購(gòu)自杭州朗基科學(xué)儀器有限公司；羅氏診斷realtime PCR 擴(kuò)增儀（型號(hào)：LC-480I和 Z480）、FYY-3型分子雜交儀均購(gòu)自深圳亞能生物技術(shù)有限公司；Fosun生物安全柜購(gòu)自上海力申科學(xué)儀器有限公司；美國(guó)BD公司BACTEC MGIT 960全自動(dòng)分枝桿菌快速培養(yǎng)鑒定藥敏儀及其配套試劑。

1.4 MTB耐藥基因芯片檢驗(yàn)方法及結(jié)果判讀

1.4.1 細(xì)菌培養(yǎng)、菌種鑒定及藥敏試驗(yàn) 所有痰標(biāo)本按照《結(jié)核病診斷細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)規(guī)程》[8]進(jìn)行BACTEC MGIT 960液體培養(yǎng)、菌種鑒定及藥敏試驗(yàn)[利福平（RFP）、異煙肼（INH）、鏈霉素（SM）、乙胺丁醇（EMB）的耐藥性]。

1.4.2 DNA提取 痰標(biāo)本1 ml加等量4%NaOH液化后，離心半徑8 cm，13 000 r/min離心5 min，混勻；離心半徑8 cm，10 000 r/min離心2 min，棄上清液。向沉淀中加入50 ml細(xì)胞裂解液，打勻，沸水浴10 min，離心半徑8 cm，10 000 r/min離心2 min，留上清液進(jìn)行PCR。

1.4.3 膜芯片設(shè)計(jì) 經(jīng)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)檢索和比對(duì)分析，設(shè)計(jì)23條特異性探針，并點(diǎn)樣至尼龍膜上，制成膜芯片。

1.4.4 PCR擴(kuò)增 取出PCR反應(yīng)管，在管壁上做好標(biāo)記，離心半徑8 cm，50 000 r/min離心2 min，加入已提取的待測(cè)樣品 DNA 4 μl。同時(shí)取兩管PCR反應(yīng)管分別加入陽(yáng)性標(biāo)本提取的DNA和陰性標(biāo)本提取的DNA，作為產(chǎn)品使用過(guò)程的質(zhì)量控制。反應(yīng)體系如下：模板 DNA 20 ng、2.5 mmol/L dNTP 2 μl，25 mmol/L MgCl21.5 μl，25 μmol/L 上、下游引物各 0.5 μl，DNA Taq 酶2.5 U，10×PCR 緩沖液 2.5 μl。使用 ABI-7300 儀器擴(kuò)增，循環(huán)條件為：50℃ 2 min，95℃ 10 min；95℃ 45 s、68 ℃ 60 s，循環(huán)次數(shù)為30；95 ℃ 30 s、54 ℃ 30 s、68 ℃60 s，循環(huán)次數(shù)為 30；68 ℃ 5 min。

1.4.5 反向斑點(diǎn)雜交技術(shù) 取檢測(cè)膜條置15 ml離心管中，加5 ml雜交緩沖液（1×檸檬酸鈉鹽、0.1%十二烷基硫酸鈉）和PCR產(chǎn)物，沸水浴10 min，58℃雜交2 h。將膜條移至裝有預(yù)熱洗液（0.5×檸檬酸鈉鹽、0.1%十二烷基鈉）的50 ml管中，于58℃輕搖洗滌15 min。用雜交緩沖液配制 1∶2 000的過(guò)氧化物酶溶液，室溫輕搖泡膜30 min，棄過(guò)氧化物酶液。用雜交緩沖液室溫輕搖洗膜2次，5 min/次。將膜條浸泡于新鮮配制的顯色液中（0.1 mol/L檸檬酸鈉19 ml、2 mg/ml四甲基聯(lián)苯胺 1 ml、3% H2O210 μl），避光顯色 5～10 min，出現(xiàn)藍(lán)色斑點(diǎn)即為含有相應(yīng)的待檢基因。

1.4.6 結(jié)果判讀 陽(yáng)性質(zhì)控品正常顯色而臨床樣本只有第CC位點(diǎn)顯色，表明被檢樣本為陰性（即無(wú)MTB）或者樣本中待檢測(cè)的MTB在本試劑盒最低檢出限以下。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件，兩種方法檢測(cè)結(jié)果的一致性采用Kappa檢驗(yàn)判讀，Kappa 0.81～1幾乎完全一致，Kappa0.61～0.80高度一致性，Kappa 0.41～0.60 中等一致性，Kappa0.21～0.40 一般一致性，Kappa0.0～0.20極低一致性[9]。采用χ2檢驗(yàn)比較基因芯片法和傳統(tǒng)比例法檢測(cè)結(jié)果的差異。計(jì)算靈敏度、特異度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 耐藥基因芯片檢測(cè)與 BACTEC MGIT 960藥敏檢測(cè)結(jié)果 161份痰標(biāo)本中，耐藥基因芯片檢測(cè)共檢出MTB基因陽(yáng)性122份，陽(yáng)性檢出率為75.78%（122/161），其中野生型58份，突變型64份，耐藥基因突變菌株占陽(yáng)性菌株的52.50%（64/122）。在122例耐藥基因芯片陽(yáng)性患者中，同時(shí)BACTEC MGIT 960培養(yǎng)結(jié)核分枝桿菌陽(yáng)性104例。對(duì)這104例患者的標(biāo)本進(jìn)行分析：基因芯片與BACTEC MGIT 960藥敏檢測(cè)同時(shí)提示耐藥為54例，同時(shí)提示敏感為38例，基因芯片提示耐藥而B(niǎo)ACTEC MGIT 960藥敏檢測(cè)敏感為5例，基因芯片提示敏感而B(niǎo)ACTEC MGIT 960藥敏檢測(cè)耐藥為7例，兩種方法一致率為88.46%（92/104），靈敏度為88.52%（54/61），特異度為 88.37%（38/43），陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值分別為 91.52%（54/59）和 84.44%（38/45）。經(jīng) χ2檢驗(yàn)，兩種方法對(duì)檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌耐藥率的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=60.75，P＜0.001），Kappa值為 0.764，兩種方法有高度的一致性。

2.2 耐藥基因芯片檢測(cè)與BACTEC MGIT 960藥敏試驗(yàn)對(duì)RFP的耐藥性檢測(cè)結(jié)果 對(duì)RFP的耐藥性檢測(cè)，耐藥基因芯片與BACTEC MGIT 960藥敏檢測(cè)同時(shí)提示RFP耐藥為42例，同時(shí)提示RFP敏感為46例，耐藥基因芯片提示RFP耐藥而B(niǎo)ACTEC MGIT 960藥敏檢測(cè)RFP敏感為1例，耐藥基因芯片提示RFP敏感而B(niǎo)ACTEC MGIT 960藥敏檢測(cè)RFP耐藥為15例，耐藥基因芯片結(jié)果與BACTEC MGIT 960藥敏檢測(cè)結(jié)果對(duì)RFP一致率為84.62%（88/104），靈敏度為73.68%（42/57），特異度為97.87（46/47），陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值分別為 97.67%（42/43）和 75.41%（46/61）。經(jīng) χ2檢驗(yàn)，兩種方法對(duì)檢測(cè)RFP耐藥率的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=55.80，P＜0.001），Kappa 值為 0.713，兩種方法有高度的一致性。

2.3 耐藥基因芯片檢測(cè)與BACTEC MGIT 960藥敏試驗(yàn)對(duì)INH的耐藥性檢測(cè)結(jié)果 對(duì)INH的耐藥性檢測(cè)，耐藥基因芯片與BACTEC MGIT 960藥敏檢測(cè)同時(shí)提示INH耐藥為42例，同時(shí)提示INH敏感為46例，耐藥基因芯片提示INH耐藥而B(niǎo)ACTEC MGIT 960藥敏檢測(cè)INH敏感為5例，耐藥基因芯片提示INH敏感而B(niǎo)ACTEC MGIT 960藥敏檢測(cè)INH耐藥為11例，耐藥基因芯片結(jié)果與BACTEC MGIT 960藥敏檢測(cè)結(jié)果對(duì)INH一致率為84.62%（88/104），靈敏度為79.25%（42/53），特異度為90.20%（46/51），陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值分別為 89.36%（42/46）和 80.70%（46/57）。經(jīng) χ2檢驗(yàn)，兩種方法對(duì)檢測(cè)INH耐藥率的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=50.60，P＜0.001），Kappa 值為 0.693，兩種方法有高度的一致性。

2.4 耐藥基因芯片檢測(cè)與BACTEC MGIT 960藥敏試驗(yàn)對(duì)SM的耐藥性檢測(cè)結(jié)果 對(duì)SM的耐藥性檢測(cè)，耐藥基因芯片與BACTEC MGIT 960藥敏檢測(cè)同時(shí)提示SM耐藥為28例，同時(shí)提示SM敏感為62例，耐藥基因芯片提示SM耐藥而B(niǎo)ACTEC MGIT 960藥敏檢測(cè)SM敏感為6例，耐藥基因芯片提示SM敏感而B(niǎo)ACTEC MGIT 960藥敏檢測(cè)SM耐藥為8例，耐藥基因芯片結(jié)果與BACTEC MGIT 960藥敏檢測(cè)結(jié)果對(duì)SM一致率為86.54%（90/104），靈敏度為 77.78%（28/36），特異度為91.18%（62/68），陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值分別為82.35%（28/34）和 88.57%（62/70）。經(jīng) χ2檢驗(yàn)，兩種方法對(duì)檢測(cè)SM耐藥率的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=50.86，P＜0.001），Kappa值為0.699，兩種方法有高度的一致性。

2.5 耐藥基因芯片檢測(cè)與BACTEC MGIT 960藥敏檢測(cè)對(duì)EMB的耐藥性檢測(cè)結(jié)果 對(duì)EMB的耐藥性檢測(cè)，耐藥基因芯片與BACTEC MGIT 960藥敏檢測(cè)同時(shí)提示EMB耐藥為12例，同時(shí)提示EMB敏感為77例，耐藥基因芯片提示EMB耐藥而B(niǎo)ACTEC MGIT 960藥敏檢測(cè)EMB敏感為3例，耐藥基因芯片提示EMB敏感而B(niǎo)ACTEC MGIT 960藥敏檢測(cè)EMB耐藥為12例，耐藥基因芯片結(jié)果與BACTEC MGIT 960藥敏檢測(cè)結(jié)果對(duì)EMB一致率為85.57%（89/104），靈敏度為50.00%（12/24），特異度為96.25%（77/80），陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值分別為 80.00%（12/15）和 86.52%（77/89）。經(jīng) χ2檢驗(yàn)，兩種方法對(duì)檢測(cè)EMB耐藥率的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=47.78，P＜0.001），Kappa值為 0.677，兩種方法有高度的一致性。

2.6 MTB耐藥基因芯片檢測(cè)結(jié)果 對(duì)這104份標(biāo)本進(jìn)行分析，其中59株耐藥基因突變的菌株，rpoB基因突變占 72.88%（43/59），katG+inhA基因突變占 79.66%（47/59），rpsL基因突變占 57.63%（34/59），embB 基因突變占25.42%（15/59），多重耐藥菌株占耐藥菌株的74.57%（44/59）。不同突變類(lèi)型各個(gè)突變基因位點(diǎn)的檢出情況見(jiàn)表1。

表1 不同突變基因在59株耐藥菌株中的檢出情況

3 討論

復(fù)治患者是耐藥肺結(jié)核的高發(fā)人群，馬艷等[10]對(duì)全國(guó)22家醫(yī)療機(jī)構(gòu)377例確診的復(fù)治肺結(jié)核患者調(diào)查問(wèn)卷顯示耐藥率為39.26%，而溫州地區(qū)老年復(fù)治患者總耐藥率高達(dá)52.27%[11]，因此，復(fù)治肺結(jié)核患者快速準(zhǔn)確的耐藥性檢測(cè)[12]及指導(dǎo)臨床用藥以提高結(jié)核病治療療效，防止耐藥MTB的產(chǎn)生和傳播具有重要意義。由于MTB生長(zhǎng)速度慢，傳統(tǒng)的藥敏試驗(yàn)周期較長(zhǎng)，需4～8周才出結(jié)果，不能為臨床提供時(shí)效性檢測(cè)結(jié)果[13]，不僅影響患者的早期診斷和治療，而且還加速了耐多藥結(jié)核病的傳播[14]。PCR熒光探針技術(shù)在快速診斷結(jié)核病中具有一定的的臨床價(jià)值[15]，但無(wú)法檢測(cè)耐藥性。GeneXpert Mtb/RIF系統(tǒng)雖然檢測(cè)MTB的靈敏度和特異度高，但僅能檢測(cè)RFP rpoB基因是否發(fā)生耐藥[16]，而且所需設(shè)備及試劑價(jià)格昂貴，維護(hù)成本較高，難以在基層單位廣泛開(kāi)展。而耐藥基因芯片法檢測(cè)不僅能同時(shí)檢測(cè)RPF、INH、SM、EMB是否發(fā)生耐藥，檢測(cè)時(shí)間僅需1 d，更實(shí)用于檢測(cè)復(fù)治肺結(jié)核所感染菌株的耐藥性。

臨床上常用的一線抗結(jié)核藥RPF、INH、SM、EMB均可產(chǎn)生耐藥。MTB耐藥基因芯片檢測(cè)系統(tǒng)根據(jù)與結(jié)核菌耐藥性高度相關(guān)的5種不同耐藥基因的突變位點(diǎn)來(lái)設(shè)計(jì)特異擴(kuò)增引物，根據(jù)不同耐藥基因的相應(yīng)突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)相應(yīng)特異探針，將高敏感度的PCR技術(shù)和高通量的反向斑點(diǎn)雜交技術(shù)相結(jié)合的基因檢測(cè)技術(shù)，可同時(shí)對(duì)導(dǎo)致上述4種抗結(jié)核藥耐受的絕大多數(shù)的突變類(lèi)型進(jìn)行檢測(cè)，具有快速、準(zhǔn)確、特異、高通量的特點(diǎn)，成為近年來(lái)研究的熱點(diǎn)。

本研究結(jié)果顯示：在122例耐藥基因芯片陽(yáng)性患者中，同時(shí)BACTEC MGIT 960培養(yǎng)MTB陽(yáng)性?xún)H104例，考慮與臨床送檢標(biāo)本質(zhì)量有關(guān)，同時(shí)需排除死菌可能。BACTEC MGIT 960藥敏檢測(cè)基因芯片檢測(cè)與BACTEC MGIT 960藥敏檢測(cè)結(jié)果一致率為88.46%（92/104），對(duì)RPF、INH、SM、EMB耐藥性檢測(cè)的一致率分別為84.62%（88/104）、84.62%（88/104）、86.54%（90/104） 和 85.57%（89/104），與白雪娟等[17]結(jié)果一致，略低于林明冠等[18]報(bào)道，考慮原因：一方面與本研究是直接檢測(cè)痰標(biāo)本中的MTB-DNA，而林明冠是檢測(cè)MTB分離株的DNA有關(guān)；另一方面與臨床標(biāo)本中結(jié)核分枝桿菌存在異質(zhì)性耐藥有關(guān)[19]。耐藥基因芯片檢測(cè)與BACTEC MGIT 960藥敏檢測(cè)結(jié)果相比，Kappa值均在0.61～0.80，提示MTB耐藥基因芯片與BACTEC MGIT 960兩種檢測(cè)法具有高度的一致性，對(duì)RPF、INH、SM、EM的耐藥性檢測(cè)同樣保持高度一致。與傳統(tǒng)藥敏試驗(yàn)相比，基因芯片技術(shù)檢測(cè)對(duì)RFP耐藥的靈敏度為73.68%（42/57），特異度為97.87（46/47），陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值分別為97.67%（42/43）和75.41%（46/61）。對(duì)INH耐藥?kù)`敏度為79.25%（42/53），特異度為90.20%（46/51），陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值分別為 89.36%（42/46）和 80.70%（46/57），與張瑞梅等[20]研究結(jié)果相似。表明基因芯片技術(shù)在臨床實(shí)際中有較好的應(yīng)用價(jià)值。

本研究采用MTB耐藥基因芯片檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行rpoB、katG、inhA、rpsL、embB 基因突變檢測(cè)，122份耐藥基因芯片陽(yáng)性標(biāo)本中，BACTEC MGIT 960培養(yǎng)結(jié)核分枝桿菌陽(yáng)性104份，其中59株發(fā)生耐藥基因突變。國(guó)內(nèi)外大量的研究數(shù)據(jù)均證明RFP的耐藥性95%左右是由編碼RNA聚合酶β亞基的rpoB基因突變引起，突變均發(fā)生在rpoB 507～533位的氨基酸組成的區(qū)域內(nèi)[21-22]。INH的耐藥性50%～70%是由編碼過(guò)氧化氫酶-過(guò)氧化物酶的katG基因的315位點(diǎn)突變引起的，5%～10%是由烯酰基還原酶編碼基因inhA的突變引起的[23]。EMB的耐藥性是由編碼糖基轉(zhuǎn)移酶（催化阿拉伯糖聚合到阿拉伯-半乳聚糖）的embB基因的306位點(diǎn)突變引起[24]，SM的耐藥性是由編碼核糖體蛋白S12的rpsL基因突變引起[25]，多發(fā)生在43位和88位氨基酸上。本研究結(jié)果顯示rpoB基因突變占72.88%（43/59），其中531位點(diǎn)突變發(fā)生率最高為47.46%（28/59），與李麗等[26]研究結(jié)果一致。katG+inhA基因突變占79.66%（47/59），其中katG315位密碼子突變 66.1%（39/59），inhA-15位突變13.56%（8/59）。rpsL 基因突變占 57.63%（34/59），embB基因突變占25.42%（15/59），其中多重耐藥菌株占耐藥菌株的74.57%（44/59），說(shuō)明溫州地區(qū)復(fù)治肺結(jié)核患者一線抗結(jié)核藥物的耐藥率高。

綜上所述，目前溫州地區(qū)復(fù)治肺結(jié)核耐藥形式嚴(yán)峻，尤其耐多藥結(jié)核面臨嚴(yán)重挑戰(zhàn)[27]。MTB耐藥基因芯片檢測(cè)系統(tǒng)能夠快速的進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌診斷檢測(cè)及一線結(jié)核藥物耐藥性監(jiān)測(cè)，且與BACTEC MGIT 960液體培養(yǎng)及藥敏試驗(yàn)保持高度一致，可成為篩查結(jié)核分枝桿菌耐藥的快速有效的方法，為臨床提供準(zhǔn)確、及時(shí)、有效的實(shí)驗(yàn)室檢查依據(jù)，使患者及時(shí)得到有效的治療，避免繼發(fā)耐藥性的產(chǎn)生，節(jié)省醫(yī)療成本，控制傳播和預(yù)后，對(duì)復(fù)治肺結(jié)核患者具有很好的臨床應(yīng)用價(jià)值。