新型冠狀病毒肺炎患者外周血四類淋巴細胞的檢測與分析

周國忠 楊明霞 錢穎

新型冠狀病毒肺炎（corona virus disease 2019，COVID-19）是新型冠狀病毒引起以肺炎為主的感染性疾病[1]，臨床表現差異較大，輕癥患者（約占80.9%）臨床表現為發(fā)熱、乏力和干咳，少數伴有流涕、咽痛、鼻塞和腹瀉等癥狀；而危重癥和重癥患者（約占19.1%）在發(fā)熱后高燒不退，1周后出現呼吸困難和低氧血癥，救治難度大，死亡率高[2-3]。COVID-19患者的機體免疫系統功能狀況是決定病情發(fā)展和預后的重要因素。本研究分析COVID-19患者血液中自然殺傷性T細胞（NKT細胞）、T淋巴細胞、B淋巴細胞和NK細胞百分比及濃度的變化，并探討這些變化的臨床意義，以期為判斷病情和選擇適當的治療方案提供更多的理論依據。

1 對象和方法

1.1 對象 選取2020年1至2月本院收治的COVID-19患者26例，男15例，女11例，年齡27～85歲。臨床表現以發(fā)熱、乏力和干咳為主，少數患者伴有鼻塞、流涕、咽痛和腹瀉等癥狀，胸部檢查兩肺早期呈現多發(fā)小斑片影及間質改變，以肺外帶明顯，進而發(fā)展為多發(fā)磨玻璃影、浸潤影，嚴重者可出現肺實變。參照《新型冠狀病毒肺炎診療方案（試行第五版修正版）》[4]，分為普通型（發(fā)熱、呼吸道等癥狀，影像學檢查可見肺炎表現）、重型[呼吸窘迫，呼吸≥30次/min；靜息狀態(tài)下，脈搏血氧飽和度≤93%；PaO2/吸氧濃度（FiO2）≤300 mmHg]和危重型（出現呼吸衰竭，且需要機械通氣；出現休克；合并其他器官功能衰竭需ICU監(jiān)護治療）。本研究中普通型14例，重型12例，無危重型。本研究經本院醫(yī)學倫理委員會審批通過。

1.2 方法 采用EDTA抗凝管采集COVID-19患者住院第2天（治療前）清晨靜脈血2 ml備用，將患者最后1次抽血檢測結果作為治療后數據。采用Navios流式細胞儀（美國貝克曼庫爾特公司）檢測T淋巴細胞亞群（CD3、CD4、CD8）、B 淋巴細胞（CD19）、NK 細胞和 NKT細胞百分率；采用淋巴細胞亞群檢測試劑盒（美國BD公司）絕對計數雙平臺法檢測上述淋巴細胞濃度。均按照試劑說明書操作。

1.3 統計學處理 采用SPSS 17.0統計軟件。符合正態(tài)分布的計量資料以±s表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗。判斷模型擬合能力的指標采用ROC曲線分析AUC、一致率，Youden指數=靈敏度+特異度-1，根據最大Youden指數確定最佳臨界點。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 重型COVID-19患者治療前后各淋巴細胞情況的比較 重型COVID-19患者治療后無一例死亡。與治療前比較，重型COVID-19患者治療后CD3細胞百分率明顯升高（P＜0.05），CD4和CD8細胞百分率明顯增加，但差異無統計學意義（P＞0.05）；CD3、CD4、CD8、CD19和NKT細胞濃度均明顯增加，但差異均無統計學意義（均P＞0.05）。與治療前比較，患者康復后NK淋巴細胞濃度和百分率均明顯下降（均P＜0.05）。見表1。

表1 重型COVID-19患者治療前后各淋巴細胞情況的比較

2.2 普通型COVID-19患者治療前后各淋巴細胞情況的比較 普通型COVID-19患者無一例死亡。與治療前比較，普通型COVID-19患者CD3細胞百分率和濃度明顯升高（均 P＜0.05）；CD4、CD8和CD19細胞百分率明顯增加，但差異均無統計學意義（均P＞0.05）；CD8和CD19細胞濃度均明顯增加（均P＜0.05），NK淋巴細胞百分率明顯下降（P＜0.05）。見表2。

2.3 普通型組和重型組治療前淋巴細胞情況的比較與普通型組治療前比較，重型組治療前CD3、CD8、NKT細胞百分率均明顯降低（均P＜0.05），CD19和NK細胞百分率明顯升高（均 P＜0.05），CD3、CD4 和 CD8、NKT細胞濃度均明顯下降（均P＜0.05），NK細胞和CD19細胞濃度升高，但差異均無統計學意義（均P＞0.05），見表3。

2.4 普通型組和重型組治療后淋巴細胞情況的比較與普通型組治療后比較，重型組治療后CD3細胞百分率明顯下降（P＜0.05），CD4、CD8和NKT細胞百分率均明顯下降，但差異均無統計學意義（均P＞0.05）；CD19和NK細胞百分率上升但差異無統計學意義（P＞0.05）；NKT、CD3、CD4、CD8 細胞濃度均下降（均 P＜0.05），NK細胞濃度升高（P＜0.05），見表4。

表2 普通型COVID-19患者治療前后各淋巴細胞情況的比較

表3 普通型組和重型組治療前淋巴細胞情況的比較

2.5 各淋巴細胞在COVID-19診斷中ROC曲線分析結果 為方便統計及分析，除了CD19細胞百分率、NK細胞百分率、CD19細胞濃度和NK細胞濃度，剩余8個指標均用倒數繪制ROC曲線，見圖1。

由圖1可見，ROC曲線分析顯示，1/CD3的AUC為0.924，95%CI：0.000～1.000，標準誤 0.001（P＜0.05），靈敏度0.818，特異度0.833，最大Youden指數0.651。1/CD4的 AUC 為 0.799，95%CI：0.616～0.982，標準誤0.015（P＜0.05），靈敏度1.000，特異度 0.500，最大 Youden指數為0.500。1/CD8 的 AUC 為 0.811，95%CI：0.627～0.994，標準誤 0.012（P＜0.05），靈敏度 0.909，特異度 0.500，最大Youden指數為 0.409。1/NKT的 AUC為 0.758，95%CI：0.552～0.963，標準誤 0.036（P＜0.05），靈敏度 0.909，特異度0.667，最大Youden指數為0.567。CD19的AUC為0.867，95%CI：0.698～1.000，標準誤 0.003（P＜0.05），靈敏度0.909，特異度0.583，最大Youden指數為0.492。1/CD3 的 AUC 為 0.795，95%CI：0.598～0.996，標準誤 0.016（P＜0.05），靈敏度 0.818，特異度 0.750，最大 Youden 指數為 0.568。1/CD4 的 AUC 為 0.795，95%CI：0.586～1.000，標準誤 0.016（P＜0.05），靈敏度 0.909，特異度 0.750，最大Youden指數為0.659。1/CD8的AUC為0.856，95%CI：0.648～1.000，標準誤 0.004（P＜0.05），靈敏度 0.818，特異度0.917，最大Youden指數為0.735。1/NKT的AUC為 0.875，95%CI：0.648～1.000，標準誤 0.002（P＜0.05），靈敏度1.000，特異度0.500，最大Youden指數為0.500。

表4 普通型組和重型組治療后淋巴細胞情況的比較

圖1 各淋巴細胞在新型冠狀病毒肺炎（COVID-19）診斷中ROC曲線

3 討論

新型冠狀病毒進入機體內會損傷肺部組織、激活免疫系統，因此大多數患者會出現發(fā)熱（特別是高熱）、干咳、乏力，小部分患者會出現流涕、鼻塞、咽痛、腹瀉、呼吸困難等，嚴重者可進展為急性呼吸窘迫綜合征、膿毒癥休克和出凝血功能障礙等癥狀[5]。普通的流感病毒也會引起肺炎和心臟衰竭等并發(fā)癥，但是COVID-19導致肺部出現嚴重的感染，而且機體出現肺炎的概率更高[6]。

本院是COVID-19收治的定點醫(yī)院，26例患者均康復出院，治愈率100%，患者體溫恢復正常，臨床癥狀好轉，肺部炎癥吸收，病毒核酸檢測陰性。在治療過程中，需要加強免疫系統，配合抗病毒藥物的應用，以及結合各種支持療法，大多數新冠肺炎患者可被治愈。因此了解COVID-19感染者的免疫狀況，配合診療程序，非常必要。

當新型冠狀病毒病原體進入機體時，免疫系統產生免疫反應，多種免疫細胞參與其中。CD3、CD4、CD8和CD19細胞屬于適應性免疫應答細胞，它們之間相互制約、平衡，參與體液免疫和細胞免疫，反應機體當前的免疫功能、狀態(tài)和平衡水平[7-8]。淋巴細胞百分率或計數絕對值可用于區(qū)別和監(jiān)測某些免疫缺陷病和自身免疫性疾病。本研究結果顯示，與治療前比較，患者合理治療后處于康復狀態(tài)期間，治療后的T細胞和B細胞數量均顯示增加，NK細胞數量顯示下降趨勢，免疫功能有明顯改善；與普通型組治療前比較，重型組治療前T細胞NKT細胞下降明顯（P＜0.05），顯示免疫系統受到明顯抑制導致患者病情加重。可見這些細胞在數量上或功能上發(fā)生變化，機體免疫平衡將被打破，導致疾病發(fā)生或病情惡化。以往研究發(fā)現SARS患者的外周血CD3、CD4、CD8細胞均明顯降低，尤其是CD4細胞降低最為明顯，反映出患者機體的免疫功明顯被抑制，這可能是病毒的直接作用。作為與SARS同源性的新型冠狀病毒，通過比較急性期普通型、重型COVID-19的T淋巴細胞數量，患者免疫功能與分型相關，隨疾病加重減低。在康復出院期，T淋巴細胞不同程度得到了恢復，普通型基本恢復正常，而重型雖然有所恢復，但還是低于普通型。實驗顯示，CD3、CD4、CD8細胞數量與患者的預后相關，若CD3、CD4、CD8細胞濃度和百分比較高，則預后較好。

固有免疫，包括NK和NKT細胞介導的免疫反應在病毒感染中的作用逐漸引起人們的重視[9]。NKT細胞是一種非傳統T淋巴細胞，既表達自然殺傷性細胞的相關受體，也表達T細胞受體[10]。主要參與機體的固有免疫，同時也是適應性免疫的參與者和調節(jié)者。在新型冠狀病毒炎癥感染中，NKT細胞作用復雜多變，有待深入研究。文獻表明NKT細胞是病毒感染早期的免疫細胞來源，能促進其它細胞如NK細胞的活化，發(fā)揮抗病毒作用[11]。NKT細胞經活化后能增強早期的抗流感病毒免疫反應[12]。NKT細胞在感染疾病中的作用機制包括抗感染免疫保護或免疫病理損傷機制還有待進一步研究。活化的NKT細胞能夠快速、大量分泌Th1、Th2類細胞因子，因此NKT細胞盡管在人體中的數量很少，但在抗感染、抗腫瘤、抑制移植排斥反應、調節(jié)多種自身免疫性疾病和炎癥性疾病中起到重要作用。在病毒感染和炎癥誘導下，NKT細胞受到刺激后，分泌大量的IL-4、IFN-γ、GM-CSF、IL-13和其它細胞因子和趨化因子，發(fā)揮免疫調節(jié)作用，NKT細胞是聯系固有免疫和獲得性免疫的橋梁之一[13]。NKT細胞活化后具有NK細胞樣細胞毒活性，可溶解NK細胞敏感的靶細胞，主要效應分子為穿孔素，Fas配體以及IFN-γ[14]。實驗結果顯示，與普通型組治療前比較，重型組的NKT細胞百分率和濃度均下降（均P＜0.05）。可見，新型冠狀病毒不同臨床癥狀惡化，NKT細胞濃度有統計學差異，反映機體不同的免疫水平。

綜上所述，新型冠狀病毒炎癥感染，NKT、CD3、CD4、CD8、NK和B淋巴細胞的百分率和濃度波動明顯，在診療中起著關鍵作用，可作為治療新型冠狀病毒疾病的靶點。