血清AFP、B7-H4聯(lián)合CP檢測(cè)對(duì)原發(fā)性肝癌的診斷價(jià)值

楊改標(biāo)，李 倩，李 璇，龔念婷，張勝梅

（中國(guó)人民解放軍32268部隊(duì)檢驗(yàn)病理科，云南大理 671003）

原發(fā)性肝癌（primary hepatic carcinoma，PHC）是臨床常見(jiàn)的惡性腫瘤，在我國(guó)死亡率高達(dá)20.14∕10 萬(wàn)，占全部惡性腫瘤死亡的18.18%〔1〕。臨床研究顯示，PHC 在早期無(wú)明顯癥狀，出現(xiàn)癥狀時(shí)已經(jīng)是中晚期，錯(cuò)過(guò)了最佳的手術(shù)時(shí)機(jī)〔2〕。因此，臨床對(duì)于PHC 的預(yù)警尤為重要，如何早發(fā)現(xiàn)、早診斷是當(dāng)前醫(yī)療技術(shù)急需解決的問(wèn)題。甲胎蛋白（alpha-fetoprotein，AFP）是PHC 診斷中常用腫瘤標(biāo)志物之一，但AFP敏感性欠佳，易造成漏診〔3〕。因此，尋找敏感性更高的腫瘤標(biāo)志物及有效的診斷方法是肝癌領(lǐng)域的研究重點(diǎn)。近年來(lái)，大量學(xué)者對(duì)AFP 聯(lián)合其他血清標(biāo)志物診斷PHC 進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)相比較于單一指標(biāo)，多指標(biāo)聯(lián)合診斷可明顯提升診斷準(zhǔn)確性〔4〕。協(xié)同刺激分子B7-H4 為B7 家族成員之一，可通過(guò)抑制固有免疫及T 細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤微環(huán)境的調(diào)節(jié)作用；銅藍(lán)蛋白（ceruloplasmin，CP）由肝臟合成，可將銅從肝臟輸送到各組織加以利用，還能調(diào)節(jié)血鐵水平及清除超氧基陰離子，兩者均與肝癌的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程密切相關(guān)，用于診斷PHC 具有一定的準(zhǔn)確性，但是目前鮮見(jiàn)有關(guān)血清AFP 聯(lián)合B7-H4及CP 用于診斷PHC 的文獻(xiàn)報(bào)道〔5〕。基于此，本研究同時(shí)檢測(cè)PHC 患者血清AFP、B7-H4 及CP，探究三者聯(lián)合檢測(cè)對(duì)PHC 的診斷價(jià)值，為早期診斷PHC提供理論基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1一般資料選取2017 年9 月至2018 年9 月在中國(guó)人民解放軍32268 部隊(duì)接受治療的42 例PHC患者作為研究對(duì)象，設(shè)為PHC 組，所有患者均符合《原發(fā)性肝癌的臨床診斷與分期標(biāo)準(zhǔn)》中有關(guān)PHC的診斷標(biāo)準(zhǔn)〔6〕并經(jīng)影像學(xué)及病理學(xué)確診；TNM 分期：Ⅰ期11 例、Ⅱ期13 例、Ⅲ期12 例、Ⅳ期6 例。同期選取肝臟良性疾病者60例作為肝臟良性疾病組，所選患者均符合《慢性乙型肝炎防治指南》中肝臟良性疾病診斷標(biāo)準(zhǔn)〔7〕；疾病類型：肝炎患者36 例，肝硬化患者24 例。選取60 例同期健康體檢者作為對(duì)照組。三組均排除合并心、肝、腎、脾等重要器官器質(zhì)性疾病及其他類型腫瘤疾病者。

1.2標(biāo)本采集所有受試者采集空腹靜脈血4 mL（住院受試者在入院后第2 天采集），置于乙二胺四乙酸抗凝管中，經(jīng)離心后收集血清，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3免疫學(xué)檢測(cè)采用電化學(xué)發(fā)光法（免疫化學(xué)發(fā)光儀，A2000Plus，鄭州安圖生物技術(shù)有限公司，中國(guó)）及其配套檢測(cè)試劑盒檢測(cè)三組血清AFP 及B7-H4含量，操作方式按照說(shuō)明書進(jìn)行。采用免疫透射比濁法（特種蛋白儀，Immage800 型，貝克曼庫(kù)爾特有限公司，美國(guó)）及其配套檢測(cè)試劑盒檢測(cè)三組血清CP 含量。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 20.0 軟件分析處理數(shù)據(jù)，計(jì)量數(shù)據(jù)以（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組數(shù)據(jù)間比較采用重復(fù)測(cè)量方差分析；計(jì)數(shù)資料采用頻數(shù)表示，進(jìn)行χ2檢驗(yàn)；AFP 與B7-H4 及CP 相關(guān)性分析采用Pearson 法。采用受試者工作特征曲線（receiver operating characteristic curve，簡(jiǎn)稱“ROC 曲線”）分析各血清指標(biāo)診斷PHC 的價(jià)值，計(jì)算ROC 曲線的曲線下面積（area under the curve，AUC）及其95%可信區(qū)間（95%CI），如果AUC＞0.5且與AUC=0.5 相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，則認(rèn)為該診斷指標(biāo)具有一定的診斷價(jià)值。在ROC 曲線上以約登指數(shù)（敏感度+特異度-1）最大的點(diǎn)作為截?cái)帱c(diǎn)，對(duì)應(yīng)值為截?cái)嘀怠＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，所有檢驗(yàn)均為雙側(cè)檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1三組受試者基線資料比較三組受試者性別、年齡等基線資料比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表1。

表1 三組受試者基線資料比較

2.2三組受試者血清AFP、B7-H4及CP含量比較PHC組患者血清AFP、B7-H4及CP含量均明顯高于肝臟良性疾病組及對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

表2 三組受試者血清AFP、B7-H4及CP含量比較（± s）

表2 三組受試者血清AFP、B7-H4及CP含量比較（± s）

注：與PHC組比較*P＜0.05。

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2.3 ROC曲線分析血清AFP、B7-H4、CP單項(xiàng)檢測(cè)及聯(lián)合檢測(cè)對(duì)PHC的鑒別診斷采用ROC 曲線分析各指標(biāo)對(duì)PHC 的診斷價(jià)值。結(jié)果顯示，血清AFP的AUC 為0.712，截?cái)嘀禐?03.78 g∕L；血清B7-H4的AUC 為0.816，截?cái)嘀禐?0.39 ng∕mL；CP 的AUC為0.754，截?cái)嘀禐?.31 g∕L。三者聯(lián)合檢測(cè)時(shí)AUC為0.897，明顯高于三者單獨(dú)檢測(cè)時(shí)的AUC，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)圖1及表3。

圖1 血清AFP、B7-H4、CP及三者聯(lián)合檢測(cè)PHC的ROC曲線

表3 血清AFP、B7-H4、CP及三者聯(lián)合檢測(cè)PHC的預(yù)測(cè)價(jià)值

2.4血清AFP、B7-H4及CP之間的相關(guān)性分析相關(guān)性分析結(jié)果顯示，AFP、B7-H4 及CP 呈兩兩正相關(guān)（r=0.594、0.362、0.412，P＜0.05）。

2.5血清AFP、B7-H4及CP陽(yáng)性檢出率比較三組受試者血清AFP、B7-H4及CP 陽(yáng)性檢出率均存在明顯差異，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。PHC組血清AFP、B7-H4及CP陽(yáng)性檢出率均明顯高于肝臟良性疾病組及對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表4。

表4 三組血清AFP、B7-H4及CP陽(yáng)性檢出率比較［n（%）］

2.6血清AFP、B7-H4及CP單項(xiàng)檢測(cè)及聯(lián)合檢測(cè)對(duì)PHC的診斷價(jià)值分析血清AFP、B7-H4及CP聯(lián)合檢測(cè)的靈敏度、特異度及準(zhǔn)確度分別為92.86%、93.33%和93.21%，均高于各指標(biāo)單項(xiàng)檢測(cè)時(shí)。見(jiàn)表5。

3 討論

PHC 是全世界最常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤之一，每年的新發(fā)病率居惡性腫瘤中的第5 位，其死亡率則高居第3 位，對(duì)人類生命安全造成巨大威脅〔8〕。大部分PHC 患者在臨床確診時(shí)已是晚期，已錯(cuò)過(guò)最佳治療時(shí)間，治療效果往往不理想。因此，尋找能早期診斷PHC 的指標(biāo)及方法對(duì)于提升PHC 的治療效果至關(guān)重要。目前，臨床上診斷PHC 主要依靠影像學(xué)及病理學(xué)技術(shù)，但這些診斷方法對(duì)于肝內(nèi)病變的良惡性鑒別較為困難，特別是PHC 與肝臟良性疾病的結(jié)節(jié)性病變難以鑒別〔9〕。研究顯示，在影像學(xué)檢測(cè)出PHC 前，腫瘤血清標(biāo)志物會(huì)先出現(xiàn)異常變化，通過(guò)監(jiān)測(cè)血清標(biāo)志物變化是診斷PHC 的有效途徑〔10〕。其中，AFP 是臨床常用的PHC 血清診斷標(biāo)志物，但研究顯示其診斷準(zhǔn)確性欠佳，采用血清AFP進(jìn)行診斷時(shí)，約30%的PHC 患者診斷為陰性〔11〕，而本研究也顯示采用血清AFP 對(duì)PHC 進(jìn)行診斷時(shí)其AUC 僅為0.712，其檢測(cè)特異度僅為75.83%，無(wú)法滿足臨床診斷需求。因此，需要進(jìn)一步尋找更有效的血清診斷標(biāo)志物來(lái)提升PHC的早期診斷率。

表5 血清AFP、B7-H4及CP單項(xiàng)檢測(cè)及聯(lián)合檢測(cè)對(duì)PHC的診斷價(jià)值［n（%）］

B7-H4是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的B7家族成員之一，對(duì)T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)具有負(fù)性調(diào)節(jié)作用。既往研究顯示，B7-H4 可通過(guò)抑制固有免疫及T 細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，在調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境中扮演著至關(guān)重要的角色，可介導(dǎo)腫瘤疾病的發(fā)生及發(fā)展過(guò)程〔12〕。正常組織不表達(dá)或低表達(dá)B7-H4，但其高表達(dá)于腫瘤組織中，主要在腫瘤細(xì)胞及腫瘤浸潤(rùn)性巨噬細(xì)胞。此外，B7-H4 還以可溶形式存在于血液中，導(dǎo)致卵巢癌、乳腺癌及非小細(xì)胞肺癌患者血清B7-H4水平異常升高。而本研究結(jié)果顯示，PHC 患者血清B7-H4水平明顯高于其他兩組，提示B7-H4 與PHC 的發(fā)生、發(fā)展也密切相關(guān)。覃慧敏等〔13〕研究顯示，B7-H4在早期診斷PHC 和良惡性肝硬化結(jié)節(jié)鑒別診斷方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，且相關(guān)性研究還證實(shí)肝臟出現(xiàn)異變之前，B7-H4 即會(huì)出現(xiàn)明顯變化。而Huang 等〔14〕研究表明，血清B7-H4 的測(cè)定不僅在良惡性肝病的鑒別診斷及PHC 的早期診斷中具有較高的應(yīng)用價(jià)值，而且可作為評(píng)估PHC 預(yù)后的可靠指標(biāo)。本研究發(fā)現(xiàn)血清B7-H4 診斷PHC 的靈敏度高達(dá)80.95%，與上述研究一致，進(jìn)一步證實(shí)其在PHC診斷中的價(jià)值。

CP 是由肝臟合成的含銅α2-糖蛋白，由細(xì)胞色素氧化酶組成，具有銅離子運(yùn)輸、血液凝固、血管生成及維持鐵平衡等多種生理功能。在正常情況下，CP 由肝臟合成后，一部分經(jīng)膽道排出，血清中約90%銅原子與CP結(jié)合，血清中CP含量、氧化酶活性及銅含量間處于平衡狀態(tài)〔15〕。但是，CP同時(shí)也是一種急性時(shí)相蛋白，CP的升高是機(jī)體對(duì)疾病的一種應(yīng)激反應(yīng)，當(dāng)機(jī)體出現(xiàn)腫瘤、炎癥等多種病理狀態(tài)時(shí)，其血清含量將明顯提升〔16〕。毛家璽等〔17〕研究顯示，相比較于健康者，肝癌患者血清CP 明顯升高，且血清CP 含量與疾病嚴(yán)重程度顯著相關(guān)，血清CP 具備作為臨床診斷慢性乙型肝炎標(biāo)志物的可能性。本研究發(fā)現(xiàn)，相比較于對(duì)照組及肝臟良性疾病組，PHC 組患者血清CP 水平明顯升高，提示CP 與PHC的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，與上述研究結(jié)果一致。此外，也有研究證實(shí)肝癌細(xì)胞本身存在CP mRNA，將刺激機(jī)體對(duì)CP 的進(jìn)一步合成，也就是說(shuō)PHC 患者血清CP 含量升高的原因不僅在于機(jī)體氧化應(yīng)激的產(chǎn)生，還與肝癌細(xì)胞自身存在CP mRNA 有關(guān)，而這種變化提示血清CP可作為肝癌的診斷標(biāo)志物〔18〕。

為了進(jìn)一步明確血清AFP、B7-H4及CP診斷PHC的價(jià)值，本研究進(jìn)行ROC 曲線分析。結(jié)果顯示，血清AFP、B7-H4 及CP 對(duì)于PHC 均有一定的診斷價(jià)值，但是三者單項(xiàng)檢測(cè)的準(zhǔn)確度均低于90%，依然無(wú)法滿足臨床需求。近年來(lái)，大量研究顯示，相比較于單一指標(biāo)檢測(cè)，多指標(biāo)的聯(lián)合檢測(cè)可顯著提升疾病診斷準(zhǔn)確度，具有更高的臨床應(yīng)用價(jià)值〔19-20〕。此外，本研究結(jié)果顯示血清AFP、B7-H4 及CP 兩兩正相關(guān)，提示三者可能同時(shí)介導(dǎo)PHC 的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程。AFP 是由胚肝細(xì)胞產(chǎn)生的一種球蛋白，在出生3 個(gè)月后達(dá)到成人水平，而當(dāng)肝細(xì)胞惡化后有重新獲得合成該蛋白的能力，導(dǎo)致機(jī)體血清AFP 水平顯著升高。肝細(xì)胞惡化后，機(jī)體出現(xiàn)應(yīng)激反應(yīng)，作為急性時(shí)相蛋白B7-H4 與CP 會(huì)發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，其血清水平均得到明顯提升，三者相互作用，共同參與PHC 的疾病發(fā)展過(guò)程。為此，本研究采用血清AFP、B7-H4 聯(lián)合CP 檢測(cè)的方式診斷PHC，結(jié)果顯示相比較于單一指標(biāo)診斷，聯(lián)合檢測(cè)時(shí)其AUC 顯著增加，診斷靈敏度、特異度及準(zhǔn)確度也得到明顯提升，提示聯(lián)合檢測(cè)血清AFP、B7-H4 及CP 對(duì)PHC患者具有更高的診斷價(jià)值。

綜上所述，聯(lián)合檢測(cè)血清AFP、B7-H4 及CP 三項(xiàng)腫瘤標(biāo)志物將顯著提升對(duì)PHC 的診斷準(zhǔn)確性，降低PHC的漏檢率，可為PHC的臨床診斷提供可靠的參考依據(jù)。