推拿對失神經肌萎縮大鼠肌特異性microRNA和肌衛星細胞增殖分化相關因子的影響

重慶醫科大學中醫藥學院，重慶市 400016

周圍神經損傷后，骨骼肌失去神經支配，出現肌萎縮[1-2]，目前主要治療手段是神經修復術。由于神經生長速度緩慢，在軸突達到靶器官前，肌肉會處于持續萎縮狀態[3]。在神經重建前延緩肌萎縮程度，對肌肉功能恢復有重要價值。

肌衛星細胞的增殖和分化是萎縮肌肉修復再生的基石[4]。肌肉受損后，肌衛星細胞激活，增殖分化為新生肌纖維參與骨骼肌再生與修復[5]。其中配對盒轉錄因子(paired box transcription factor 7,Pax7)是維持肌衛星細胞增殖水平的重要標志分子。肌肉受損后，Pax7表達上調，激活肌衛星細胞增殖、分化。成肌分化抗原(myogenic differentiation antigen,MyoD)和肌細胞生成素(myogenin,MyoG)是肌衛星細胞分化的關鍵調節因子，也是Pax7 的下游分子；MyoD 為初級分化因子，主要調控成肌分化；MyoG 為次級分化因子，主要調控肌管終末分化形成成熟肌纖維[6]。microRNA是涉及轉錄后基因沉默的一類非編碼RNA，其中microRNA-133a、microRNA-206 和microRNA-1 為肌特異性microRNA，對Pax7、MyoD、MyoG 的表達具有調控作用[7]。

推拿是中醫的重要組成部分，對骨和軟組織損傷有很好療效[8-9]。本研究觀察推拿對失腓總神經大鼠腓腸肌中microRNA-133a、microRNA-206、microRNA-1、Pax7、MyoD、MyoG 表達的影響，從肌衛星細胞增殖分化的角度探討推拿干預失神經肌萎縮的可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

SPF 級健康雄性Sprague-Dawley 大鼠42 只，體質量(270±10) g，由成都達碩實驗動物有限公司提供，動物合格證號SCXK(川)2015-030。分籠飼養，室溫(22±2) ℃，相對濕度(60±5)%，明暗12 h 交替，飲食水自由攝取。

適應性喂養1 周后，大鼠編號，計算機自動生成42個兩位數的隨機數字表，每個編號對應一個隨機數字，再按隨機數字的大小重新排列，序號1～6 為假手術組(n=6)，7～25 為模型組(n=18)，26～42 為推拿組(n=18)。

實驗中對動物的處置均遵照重慶醫科大學倫理委員會標準。

1.2 試劑及儀器

SYBR Premix Ex TaqTMⅡ，RR047A 反轉錄試劑盒，Trizol 總RNA 提取液，Pax7、MyoD1、MyoG、microRNA-1、microRNA-133a、microRNA-206 引 物合成：日本TAKARA 公司。柔軟型大鼠固定器：溫州原上草醫療科技有限公司。AL204 型電子天平：瑞士METTLER TOLEDO 公司。低溫高速離心機：美國SIGMA 公司。ThermoND 2000 超微量核酸蛋白測定儀：上海GENE 公司。T100TM聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction,PCR)儀、CFXPCR 檢測系統：美國BIO RAD 公司。冰凍切片機：德國LEICA 公司。CellSens Standard 圖像采集軟件、BX53 正置顯微鏡：日本OLYMPUS公司。AFY-10型小動物按摩器：天津愛福依科技有限公司。RPM薄膜壓力測試儀：上海邑成測試設備有限公司。

1.3 造模

大鼠10%水合氯醛3 ml/kg 腹腔注射麻醉，無菌條件下右股外側切口，鈍性分離肌肉，暴露脛神經并游離。模型組和推拿組切除腓總神經約1 cm；假手術組只暴露神經，不離斷[10]。逐層縫合后自由進食、飲水。

1.4 干預方法

術后第2天起，推拿組以柔軟型大鼠固定器固定，待情緒穩定后，將動物按摩器按摩頭固定于術側下肢，RPM 薄膜壓力測試儀測試，縱向壓力5 N，轉速2600 r/min，時長15 min，每天1 次[10]。假手術組和模型組僅固定，不進行任何干預。

1.5 檢測方法

模型組和推拿組分別于術后14 d、21 d、28 d，隨機數字表法取6 只大鼠，頸椎脫臼法處死。假手術組于術后28 d同法一次性處死。

1.5.1 腓腸肌濕重比測定

從股骨內外髁起點到跟骨結節處完整取下雙側腓腸肌，吸干表面殘留液體，立即電子天平稱量濕重，計算腓腸肌濕重比(術側/非術側)。

術側腓腸肌組織分為兩份，一份快速液氮冷凍后-80 ℃冰箱保存備用，另一份4%多聚甲醛固定，包埋，行形態學檢測。

1.5.2 組織學觀察

腓腸肌4%多聚甲醛固定后，梯度乙醇脫水，浸蠟包埋后，石蠟切片，厚3 μm，行HE 染色。隨機取3張切片，400倍光學顯微鏡觀察，每張切片隨機選取4 個視野拍照，每個視野選20 個細胞，Image Pro Plus 6.0圖像分析軟件計算腓腸肌細胞直徑和面積。

1.5.3 逆轉錄實時定量PCR

冰凍保存的腓腸肌60 mg，置于2.0 ml 無酶EP 管中，Trizol 法提取總RNA，超微量核酸蛋白測定儀檢測總RNA 濃度和純度后定量，根據反轉錄試劑盒操作步驟配制反應體系，置于T100TMPCR 儀中反轉錄成cDNA，SYBR Green 法配制反應體系，行定量PCR，并讀取Ct值。以β-actin為Pax7、MyoD、MyoG內參，以u6 為microRNA-1、microRNA-133a、microRNA-206的內參，計算目的基因2-ΔΔCt。引物序列如下。

Pax7：上游5'-GCA GTC GGA CCA CAT TCA CG-3'；下游5'-GCA CGA CGG TTA CTG AAC CAG A-3'。

MyoG：上游5'-CCA GAC TAC CCA CCG TCC ATT-3'；下游5'-CTG AGT TTG CCC CGT TGA GG-3'。

MyoD：上游5'-CGC CTG AGC AAA GTG AAC GA-3'；下游5'-CAG ACC TTC AAT GTA GCG GAT G-3'。

microRNA-206：上游5'-CTG GAA TGT AAG GAA GTG TGT GG-3'；下游5'-ACA CTT CCT TAC ATT CCA GCC-3'。

microRNA-133a：上游5'-TGG TCC CCT TCA ACC AGC TG-3'；下游5'-TGG TTG AAG GGG ACC AAA GCC-3'。

microRNA-1：上游5'-GGC TGG AAT GTA AAG AAG TGT GTA T-3'；下游5'-ATA CAC ACT TCT TTA CAT TCC AGC C-3'。

β-Actin：上游5'-ACG GTC AGG TCA TCA CTA TCG-3'；下游5'-GGC ATA GAG GTC TTT ACG GAT G-3'。

u6：上游5'-CTC GCT TCG GCA GCA CA-3'；下游5'-AAC GCT TCA CGA ATT TGC GT-3'。

1.6 統計學分析

2 結果

2.1 腓腸肌濕重比

各時間點模型組和推拿組腓腸肌濕重比均小于假手術組(P＜0.05)，并呈下降趨勢；推拿組各時間點腓腸肌濕重比均高于模型組(P＜0.05)。見表1。

表1 各組腓腸肌濕重比較

2.2 HE染色

假手術組肌細胞大小正常，肌纖維排列正常；模型組和推拿組時間延長，肌纖維排列逐漸混亂，肌細胞截面積逐漸減小；模型組較推拿組變化明顯。見圖1。

除14 d 時推拿組肌細胞面積與假手術組無顯著性差異(P＞0.05)外，各個時間點模型組和推拿組肌細胞面積和直徑均小于假手術組(P＜0.05)，并呈下降趨勢；推拿組各個時間點肌細胞面積和直徑均高于模型組(P＜0.05)。見表2、表3。

2.3 PCR

模型組和推拿組Pax7表達均呈下降趨勢。模型組14 d時Pax7表達高于假手術組(P＜0.05)，21 d時與假手術組無顯著性差異(P＞0.05)，28 d 時低于假手術組(P＜0.05)；推拿組14 d 和21 d 時Pax7 表達高于假手術組(P＜0.05)，28 d 時與假手術組無顯著性差異(P＞0.05)；各時間點Pax7 表達均高于模型組(P＜0.05)。見表4。

模型組和推拿組MyoD 和MyoG 表達均呈先上升后下降趨勢。各時間點模型組和推拿組MyoD 和MyoG 表達均高于假手術組(P＜0.05)；除14 d 時MyoG 表達外，推拿組各時間點MyoD 和MyoG 表達量高于模型組(P＜0.05)。見表5、表6。

表2 各組腓腸肌肌細胞直徑比較(μm)

表3 各組腓腸肌肌細胞面積比較(μm2)

表4 各組腓腸肌Pax7表達比較(2-ΔΔCt)

表5 各組腓腸肌MyoD表達比較(2-ΔΔCt)

圖1 各組腓腸肌細胞形態(HE染色,×400)

模型組和推拿組microRNA 表達僅取21 d 時的數據。21 d 時，模型組和推拿組microRNA-1 和microRNA-133a 表達均低于假手術組(P＜0.05)，microRNA-206 表達高于假手術組(P＜0.05)；推拿組microRNA-1、microRNA-133a 和microRNA-206 表達均高于模型組(P＜0.05)。見表7。

表6 各組腓腸肌MyoG表達比較(2-ΔΔCt)

表7 21 d時各組腓腸肌各microRNA表達比較(2-ΔΔCt)

3 討論

推拿治療肌肉萎縮有著悠久歷史。隨著醫學的發展，推拿促進骨骼肌損傷修復的分子生物學機制也逐步被認識[8]。我們前期已分別從細胞自噬[10]和蛋白質降解[11]兩個方面證明推拿具有延緩失神經肌萎縮的作用。本實驗將從肌衛星細胞增殖分化的角度，探討推拿延緩失神經肌萎縮的效應。

肌衛星細胞是肌肉組織的干細胞，是肌肉自我修復再生的基石[12]。骨骼肌受損后，肌衛星細胞被立即激活，并在24 h 內進入細胞周期進行有絲分裂，這時，Pax7是靶向上調肌衛星細胞增殖的關鍵因子[13-14]。Pax7的下游是負責肌衛星細胞向肌源性分化的肌源性調節因子(myogenic regulatory factors,MRFs)[15]，MyoD 和MyoG 都是MRFs 家族成員[16-17]。Pax7 可通過直接結合MyoD 遠端增強元件和近端啟動子，誘導MyoD 表達，使肌衛星細胞分化為扁圓形成肌細胞；MyoD 誘導下游次級分化因子MyoG 表達，使扁圓形成肌細胞轉變為梭形，相互融合為肌管，最后成為成熟肌纖維[18-20]。Pax7/MyoD/MyoG 形成的信號通路在失神經骨骼肌增殖和分化過程中扮演著重要角色。

研究顯示[21-22]，切斷坐骨神經初期，腓腸肌Pax7表達量是正常大鼠的3～5 倍；隨時間延長，Pax7 表達進行性下降，肌衛星細胞增殖速度也逐漸減慢，最終導致肌衛星細胞池耗竭。本研究顯示，在失神經初中期，Pax7 的表達量是正常大鼠的2 倍，之后隨時間推移呈下降趨勢；推拿能有效刺激失神經后期Pax7的表達，提示能促進肌衛星細胞增殖，延緩肌肉萎縮。

另一方面，腓腸肌中分化相關因子MyoD 和MyoG 在失神經中期表達最明顯[23]，提示細胞分化活躍。如肌衛星細胞無法增殖，MyoD 和MyoG 的表達也會下降[22]。范蕊等[24]電針干預創傷性脊髓損傷大鼠，也發現上調MyoD和MyoG的表達可減輕腓腸肌萎縮。趙丹丹等[25]發現，電針干預失坐骨神經大鼠可刺激大鼠腓腸肌產生適應性肥大，并刺激MyoD 和MyoG 表達。本研究顯示，失神經21 d 后，MyoD 和MyoG 表達呈下降趨勢，提示肌衛星細胞分化水平下降；推拿可提高MyoD 和MyoG 表達，可能刺激肌衛星細胞分化，延緩肌肉萎縮。

microRNA 是一類長度約為22 個核苷酸的非編碼RNA，與靶基因mRNA 3'UTR 端互補序列結合后，發揮調控靶基因表達的作用。已發現多種microRNA 被證明在肌肉發生發育、損傷修復中起關鍵作用[26]。其中microRNA-133a、microRNA-206 和microRNA-1 是肌肉組織特異性表達的microRNA。敲除microRNA-133a、microRNA-206 和microRNA-1 會加劇肌肉萎縮[27]。這三種肌特異性microRNA 主要通過對Pax7/MyoD/MyoG 信號通路的調控，參與骨骼肌修復[28]。肌生成抑制素8 (growth differentiation factor 8,GDF8)作為microRNA-133a、microRNA-206 和microRNA-1的共同靶基因，能抑制Pax7表達；在肌衛星細胞增殖期間，microRNA-133a、microRNA-206 和 microRNA-1 通過抑制GDF8 的表達，實現對Pax7 的調控。microRNA-1 和microRNA-206 下調MyoD 的抑制因子MyoR，從而上調MyoD 表達，促進成肌分化[29-30]。Nakasa 等[31]發現，向脛骨前肌損傷模型大鼠局部肌肉注射microRNA-133a、microRNA-206 和microRNA-1 混合物，能有效誘導Pax7、MyoD 和MyoG表達，促進肌肉修復。劉澤遠等[30]認為，被動運動通過促進microRNA-1 的表達，以促進MyoD 表達，進而促進成肌細胞分化，達到防止失神經肌萎縮的作用。何玉童等[32]在體外對小鼠C2C12 成肌細胞進行周期性機械牽拉，肌特異性microRNA 表達發生變化，引起MyoD和MyoG表達升高。

研究發現[33]，失神經肌肉中肌特異性microRNA誘導會出現延遲：失神經早期肌肉還未萎縮，萎縮相關基因表達升高，而microRNA 表達受抑制；失神經中后期，肌肉萎縮并開始誘導microRNA 參與萎縮程序的調控。本團隊前期研究也發現[11]，失神經早期和終末期，肌肉中microRNA 表達不顯著。故本研究僅檢測21 d時microRNA。結果顯示，推拿組microRNA表達上升，結合同時間點Pax7、MyoD 和MyoG 表達也顯著增加，提示推拿可能通過促進肌特異性microRNA的表達，調控Pax7/MyoD/MyoG通路。

綜上所述，推拿延緩失神經肌萎縮的可能機制之一是通過上調肌特異性microRNA 的表達，促進Pax7/MyoD/MyoG 通路轉錄，刺激肌衛星細胞增殖、分化，形成新生肌纖維參與肌肉修復，達到延緩失神經肌萎縮的目的。

利益沖突聲明：所有作者聲明不存在利益沖突。