前列腺癌組織中TEM8與VEGF的表達及臨床意義

李明鳳，方林娜，計 翼，胡沛然，孫 林，王悅晨，孫禮潔，尹 玉,3

前列腺癌是我國男性泌尿系統常見的惡性腫瘤之一。前列腺特異性抗原(prostate-specific antigen, PSA)是前列腺癌檢測、診斷、分級和預測預后的重要生物學標志物，但其不具有前列腺癌的特異性且無法區分惰性疾病和侵襲性疾病[1]。因此，尋找新的特異的生物學標志物，并探討其是否可以作為治療靶點，對明確病理診斷及患者的治療均具有重要意義。腫瘤血管內皮標志物8(tumor endothelial marker 8, TEM8)在多種腫瘤細胞和腫瘤相關細胞(如腫瘤內皮細胞、周細胞和癌成纖維細胞)中表達上調，在腫瘤細胞的遷移、黏附和腫瘤血管生成等生理過程中發揮重要作用[2]。血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)作為血管生成的主要調節因子，能夠特異性地作用于血管內皮細胞，在腫瘤細胞的快速生長和轉移中發揮重要作用。本實驗采用免疫組化MaxVision法檢測前列腺癌組織和前列腺增生組織中TEM8和VEGF蛋白表達，探討兩者表達的相關性及臨床意義，旨在為前列腺癌的治療尋找新靶點。

1 材料與方法

1.1 臨床資料選取2015～2017年安徽醫科大學第一附屬醫院存檔的行前列腺穿刺活檢、前列腺癌電切術、前列腺癌根治術的前列腺組織標本94例。標本均經病理醫師明確診斷，均有詳細的臨床病理資料，且患者術前均未行任何治療。94例標本中前列腺癌標本71例，患者年齡47～88歲，平均69.03歲；前列腺增生組織標本23例，患者年齡59～81歲，平均69.43歲。采用美國癌癥聯合委員會(AJCC)分類法對前列腺癌組織進行TNM臨床分期，并采用與預后密切相關的五級法進行Gleason評分，即對同一組織不同區域腺癌結構的變異，按照主要和次要分化程度分別評分，最終以兩項評分相加的總分劃分前列腺癌組織為中+高分化腺癌組(Gleason評分≤7)和低+未分化癌組(Gleason評分>7)。實驗中選取的23例前列腺增生標本作為前列腺癌標本的對照組。

1.2 試劑TEM8鼠單克隆抗體(1 ∶20，NOVUS，200C1339)、VEGF鼠單克隆抗體(1 ∶100，Abcam公司，ab1316)以及購自北京中杉金橋公司的通用型酶標山羊抗鼠/兔聚合物、PBS緩沖液粉劑、檸檬酸鹽抗原修復液、DAB酶底物顯色試劑盒以及免疫組化試劑盒。

1.3 方法免疫組化染色采用MaxVision法。所有標本均經10%中性福爾馬林固定，常規脫水，石蠟包埋后連續4～5 μm厚切片。組織標本經烤片、梯度乙醇脫水、抗原修復以及過氧化物酶阻斷等一系列處理后，滴加一抗，4 ℃過夜孵育。HRP辣根酶標記的二抗室溫下孵育。實驗中以PBS代替一抗作為陰性對照，已知陽性標本作為陽性對照。

1.4 結果判讀將免疫組化切片置于光鏡下觀察，以免疫顯色強度和陽性細胞密度作為定量評分標準進行判讀。TEM8陽性定位于前列腺癌和前列腺增生組織中腺上皮細胞的胞質和胞膜(圖1)，VEGF陽性定位于前列腺癌和前列腺增生組織中腺上皮細胞的胞質。觀察待檢測組織相應部位出現彌漫均質的淡黃色細顆粒、棕黃色顆粒以及褐黃色粗顆粒的程度，無細胞著色為0分，弱陽性為1分，中等陽性為2分，強陽性為3分；結合TEM8、VEGF染色陽性細胞密度進行評分，陽性細胞數≤25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，76%～100%為4分。參照文獻[3-4]，以兩項評分的乘積作為最終的判斷結果，≤7分為陰性組，>7分為陽性組。

1.5 統計學分析采用SPSS 25.0軟件進行χ2檢驗和Spearman等級相關分析檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 前列腺癌組織和前列腺增生組織中TEM8、VEGF的表達TEM8在前列腺癌組織中的陽性率為60.6%(43/71)(圖1)，在前列腺增生組織中的陽性率為21.7%(5/23)，兩者差異有統計學意義(χ2=10.479，P<0.05)；VEGF在前列腺癌組織中的陽性率為59.2%(42/71)，在前列腺增生組織中的陽性率為13%(3/23)，兩者差異有統計學意義(χ2=13.120，P<0.05，表1，圖2)。值得注意的是，20例轉移性前列腺癌組織中TEM8的陽性率為85%(17/20)，51例非轉移性前列腺癌組織中TEM8的陽性率為51.0%(26/51)，差異有統計學意義(P<0.05)；轉移性前列腺癌組織中VEGF的陽性率為80%(16/20)，非轉移性前列腺癌組織中VEGF的陽性率為51.0%(26/51)，差異有統計學意義(P<0.05，表2)。

表1 前列腺增生及前列腺癌組織中TEM8和VEGF的表達

表2 非轉移性前列腺癌及轉移性前列腺癌組織中TEM8和VEGF的表達

圖1 TEM8免疫組化結果判讀：A.前列腺癌細胞無著色為0分；B.弱陽性為1分；C.中等陽性為2分；D.強陽性為3分，MaxVision法 圖2 A.TEM8在前列腺增生組織中呈陰性，MaxVision法；B.TEM8在前列腺癌組織中呈陽性，MaxVision法；C.VEGF在前列腺增生組織中呈陰性，MaxVision法；D.VEGF在前列腺癌組織中呈陽性，MaxVision法

2.2 TEM8、VEGF表達與前列腺癌臨床病理特征的關系TEM8高表達與前列腺癌組織的Gleason評分、TNM分期以及骨轉移相關(P<0.05)，與患者年齡、術前PSA水平無關(P>0.05)。VEGF的高表達與前列腺癌組織的TNM分期以及骨轉移相關(P<0.05)，與患者年齡、術前PSA水平和Gleason評分無關(P>0.05，表3)。

表3 TEM8、VEGF表達與前列腺癌臨床病理特征的關系[n(%)]

2.3 前列腺癌組織中TEM8與VEGF表達的相關性前列腺癌組織中TEM8和VEGF同時陽性33例，同時陰性19例；兩者之間呈顯著正相關(rs=0.443，P<0.001，表4)。

表4 前列腺癌組織中TEM8與VEGF表達的相關性

3 討論

前列腺惡性腫瘤的治療方法通常有內分泌治療、手術治療、放化療。手術切除和內分泌治療可使早期前列腺癌患者出現短期癥狀的緩解，不幸的是，疾病在一段時間后可能進展為惡性程度更高的難治性前列腺癌，放、化療對腫瘤細胞選擇性差且具有難以避免的副作用，這些均使前列腺癌的治療受阻。Folkman[5]提出腫瘤血管新生理論，認為腫瘤生長到一定程度時，腫瘤的持續生長取決于其是否有充足的血液供應，抗腫瘤血管新生理論的提出為癌癥診療提供新方向。腫瘤脈管系統為腫瘤的快速增殖和轉移提供了充足的血液供應，同時也為腫瘤細胞逃逸提供了轉移的路徑，TEM8和VEGF作為抗腫瘤血管生成的候選分子，已被發現在多種腫瘤細胞中存在過表達趨勢[6]。

TEM8是整合素樣細胞表面跨膜蛋白，最初因其在結直腸腫瘤內皮細胞中高表達而被鑒定出來，隨后TEM8被發現是炭疽毒素的受體，介導炭疽毒素進入細胞[7]。TEM8特異性地表達于腫瘤內皮細胞和癌細胞中，提示TEM8作為腫瘤治療靶點具有潛在的優勢。TEM8基因敲除小鼠實驗證明，敲除TEM8基因后，小鼠正常的生長發育及傷口的愈合均未受到影響，但其體內出現大量細胞外基質沉積，提示TEM8在維持細胞外基質穩態方面發揮作用[2]。在裸鼠移植瘤模型中，靶向TEM8的特異性抗體能夠同時靶向三陰型乳腺癌干細胞和腫瘤相關血管系統，誘導瘤體消退[8]。研究表明，在嬰幼兒血管瘤中TEM8與血管內皮生長因子受體2(VEGFR2)在功能上相互作用并參與對下游VEGF信號通路的調控[9]。TEM8的高表達已被發現與乳腺癌、結腸癌和骨肉瘤等疾病的不良預后水平相關[7,10]。盡管如此，TEM8的生理功能尚不十分清楚，有待進一步研究證實。

VEGF又稱血管通透因子，定位于人類染色體6p21，由2個相同多肽鏈通過二聚體聚合而成，具有促進內皮細胞有絲分裂和抗凋亡的作用。VEGF可誘導肺腺癌細胞、白血病細胞、卵巢癌細胞和乳腺癌細胞的遷移和侵襲[11]。除此之外，VEGF通過信號轉導誘導血管瘤內皮細胞的增殖，在嬰幼兒血管瘤的發展中起重要作用。靶向VEGF/VEGFR2軸的治療藥物已在臨床上用于多種癌癥的治療(如結腸癌、肺癌、腦癌、腎癌等)[12]。文獻報道[13-14]，從健康對照組、局限性前列腺癌組到轉移性前列腺癌組，血漿VEGF水平逐漸升高且VEGF的表達與前列腺癌患者生存期密切相關。因此，抗VEGF治療已成為前列腺癌多項臨床試驗的目標。VEGF是腫瘤血管新生所必需的因子，其在正常血管生成過程中亦可發揮作用，在腫瘤微環境中的VEGF表達受多種因素的調節(如低氧環境、雄激素水平等)。TEM8的高表達亦可誘導腫瘤組織的血管新生，但相比于VEGF，TEM8基因敲除的動物模型表明其并非正常生理狀態所必需的因子，這種特異性表達于腫瘤細胞和腫瘤脈管系統的能力使得TEM8更具治療的潛力。TEM8、VEGF促進前列腺癌進展的分子機制及兩者是否存在相關信號通路仍有待研究和證實。

本實驗通過檢測TEM8、VEGF在不同分期和分級的前列腺癌組織中的差異性表達，試圖探討兩者在前列腺癌中的臨床病理學意義。結果顯示，TEM8、VEGF的表達與前列腺癌組織的TNM分期以及骨轉移密切相關，由此推斷TEM8、VEGF可能在前列腺癌的發展和轉移中發揮作用。TEM8和VEGF的表達有明顯的相關性，提示兩者可能在前列腺癌的發生、發展中發揮協同作用。因此，TEM8、VEGF有望成為前列腺癌靶向治療的新靶點。