基于自噬相關的PI3K-AKT-mTOR通路研究益氣化瘀方對心肌缺血再灌注損傷的改善作用

黃國強，李雪山

(中山市中醫院，廣東 中山)

0 引言

心肌缺血再灌注損傷(myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI)屬臨床常見心肌損傷癥狀，心肌損傷會造成心肌細胞壞死和凋亡[1]。因此，本研究推測益氣化瘀方可能通過影響PI3K-AKT-mTOR通路實現對MIRI自噬的影響，建立MIRI模型，探討益氣化瘀方對MIRI的保護作用及初步探究其機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

Wistar雄性SPF級大鼠。

1.2 試劑與方法

益氣化瘀方組成：丹參20 g，仙鶴草、五爪龍各15 g，田七、紅景天各10 g，上述煎煮2次，濃縮成每毫升0.6g生藥。雷帕霉素；親和素-生物素-過氧化物酶復合物染色；免疫組化試劑盒；一抗兔抗鼠哺乳動物同族物微管相關蛋白1輕鏈3、PI3K及其磷酸化水平、AKT及其磷酸化水平、mTOR、β-actin。

1.3 研究方法

1.3.1 模型建立及藥物處理

實驗前大鼠禁食過夜，參考文獻[2]方法建立MIRI模型，腹腔注射戊巴比妥鈉(40 mg/kg)麻醉后固定于實驗臺上，氣管插管，接小動物呼吸機機械通氣。逐層撥開胸廓，露出心臟，分離右側頸總動脈，將心導管經右側頸動脈插入左心室，以監測左心室壓力。沿胸骨左緣2-3 mm處行切口，逐層分離處胸肌后，于第4肋間夾閉肋間血管，剪斷肋骨，充分暴露左心耳及左心室。小心撕開心包，在左心耳下緣2 mm處，以無創小圓針帶6-0絲線進針穿過冠狀動脈左降支下方的心肌表層，將縫線兩端引出硅膠套管(硅膠套管一端緊貼左心室壁)，收緊結扎線，檢測大鼠心電圖(electrocardiogram，ECG)，以ECG ST段明顯抬高為結扎成功的標志。持續缺血30 min，松開結扎線，使缺血心肌再灌注2 h，ECG出現病理性Q波，ST段至正常水平，心肌灌注成功。模型成功后隨機分為模型組、益氣化瘀方組、自噬激動劑組，每組12只。假手術組僅打開胸腔暴露出心臟穿絲線而不結扎。所有動物每天腹腔注射50000 U/d青霉素防止感染。

益氣化瘀方組每天灌胃15.9 g/kg益氣化瘀方[3]，自噬激動劑組每天灌胃5 mg/kg雷帕霉素[4]，假手術組和模型組每天灌胃等體積的生理鹽水，連續10 d。

1.3.2 TTC染色檢測心肌梗死體積

實驗結束后迅速摘除大鼠心臟，預冷PBS中清洗，置于-20℃冰箱中冷凍25 min。平行于心室將心臟橫切成5片，于1% TTC磷酸緩沖液中37℃孵育20 min，10%甲醛室溫固定1 h。拍照并用Image-J軟件分析梗死百分比。其中正常心肌呈紅色，梗死區呈白色，每組4只。

1.3.3 蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin staining，HE)染色觀察大鼠心肌組織病理學變化情況

每組剩余大鼠8只，迅速摘除大鼠心臟，部分置于4%多聚甲醛中固定，固定后制備石蠟切片；部分采用戊二醛-鋨酸雙重固定法固定，超薄切片機切片；部分置于-80℃冰箱中保存待檢。

每組取出部分心肌組織石蠟切片，使用HE染色試劑盒對心肌組織進行染色，中性樹脂封片，顯微鏡拍照觀察心肌組織病理學變化情況。

1.3.4 電鏡觀察大鼠心肌細胞超微結構情況

每組取超薄切片，醋酸雙氧鈾-枸櫞酸鉛雙重染色，透射電鏡對心肌細胞超微結構拍照。

1.3.5 免疫組化檢測心肌組織中自噬蛋白LC3蛋白情況

每組取出部分心肌組織石蠟切片，經二甲苯、梯度酒精浸泡后，使用ABC免疫組化試劑盒對LC3(1：200)進行染色，具體操作步驟按說明書進行。

1.3.6 免疫印跡法檢測心肌組織中PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、mTOR蛋白表達情況

從-80℃冰箱中取出心肌組織，RIPA裂解液裂解組織，提取總蛋白，上樣20μg，PVDF轉膜后封閉，一抗PI3K(1：1000)、p-PI3K(1：1000)、AKT(1：1000)、p-AKT(1：1000)、mTOR(1：2000)、β-actin(1：10000)4℃孵育過夜，加入對應二抗，ECL化學發光液顯色、Image-J軟件定量掃描蛋白條帶灰度值，蛋白相對表達水平=目標蛋白灰度值/內參β-actin蛋白灰度值。

1.4 統計學處理

本研究數據采用SPSS 24.0軟件進行分析。計量資料以均數±標準差(±s)描述，多組間比較行單因素方差分析，進一步兩兩比較采用SNK-q檢驗。P＜0.05，差異有統計學意義。

2 結果

2.1 建模大鼠不同時段ECG

結扎前，ECG正常；結扎30 min后大鼠ECG ST段明顯抬高；松開結扎線2 h，ECG可見病理性Q波，ST段下降至正常水平，心肌再灌注成功。見圖1a、b、c。

2.2 益氣化瘀方對大鼠心肌梗死影響

與假手術組相比，模型組心肌梗死體積升高(P＜0.05)；與模型組相比，益氣化瘀方組、自噬激動劑組心肌梗死體積降低(P＜0.05)。見圖2、表1。

圖1 建模大鼠不同時間心電圖

圖2 4組大鼠心肌梗死體積情況

圖3 4組大鼠心肌組織病理情況(200×)

圖4 4組大鼠心肌細胞超微結構情況(8000×)

圖5 4組大鼠心肌組織自噬蛋白LC3水平(200×)

表1 4組大鼠心肌梗死體積比較(±s，n=4)

表1 4組大鼠心肌梗死體積比較(±s，n=4)

注：與假手術組相比，#P＜0.05；與模型組相比，*P＜0.05。

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2.3 益氣化瘀方對大鼠心肌組織形態影響

假手術組心肌細胞形態正常，排列規則；模型組心肌細胞排列紊亂，肥大現象明顯，呈現壞死現象，炎癥浸潤明顯；益氣化瘀方組心肌細胞得到改善、逐漸恢復，細胞損傷減輕；自噬激動劑組心肌細胞形態雖有所減輕，但癥狀不明顯，細胞肥大、壞死現象存在，炎癥有所減輕。見圖3。

2.4 益氣化瘀方對大鼠心肌組織超微結構影響

假手術組心肌細胞、心肌纖維排列整齊，肌小結完整，線粒體完整；模型組心肌細胞排列紊亂、不緊密，心肌纖維斷裂、溶解、紊亂，肌小結破壞，線粒體損傷；益氣化瘀方組與假手術組相似，心肌細胞、心肌纖維排列較整齊，肌小結較完整，線粒體完整；自噬激動劑組狀況介于模型組和益氣化瘀方組之間，心肌細胞、心肌纖維排列整齊，肌小結破壞現象得到改善，線粒體出現損傷但程度小。見圖4。

2.5 益氣化瘀方對大鼠心肌組織自噬蛋白LC3影響

與假手術組相比，模型組心肌組織中LC3陽性細胞比例降低(P＜0.05)；與模型組相比，益氣化瘀方組、自噬激動劑組心肌組織中LC3陽性細胞比例升高(P＜0.05)。見圖5、表2。

表2 4組大鼠心肌組織中LC3陽性細胞比例比較(±s，n=8)

表2 4組大鼠心肌組織中LC3陽性細胞比例比較(±s，n=8)

注：與假手術組相比，#P＜0.05；與模型組相比，*P＜0.05。

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2.6 益氣化瘀方對大鼠心肌組織PI3K-AKT-mTOR通路蛋白影響

4組心肌組織中PI3K、AKT蛋白差異無統計學意義(P＞0.05)。與假手術組相比，模型組心肌組織中p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、mTOR蛋白水平升高(P＜0.05)；與模型組相比，益氣化瘀方組、自噬激動劑組心臟組織中p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、mTOR蛋白水平降低(P＜0.05)。見圖6、表3。

圖6 4組心肌組織中PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、mTOR蛋白水平

表3 4組心肌組織中PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、mTOR蛋白水平比較(±s，n=8)

表3 4組心肌組織中PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、mTOR蛋白水平比較(±s，n=8)

注：與假手術組相比，#P＜0.05；與模型組相比，*P＜0.05。

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3 討論

綜上所述，益氣化瘀方能夠保護MIRI，可能是通過抑制PI3K-AKT-mTOR通路進而促進心肌細胞自噬實現的。但影響自噬通路較多且復雜，益氣化瘀方亦可能調控別的通路作用于心肌細胞實現對MIRI的保護[5]，探究更多信號通路對MIRI的影響是本研究接下來研究內容。