梅山豬與杜洛克豬卵泡中circ0010513的鑒定及分析

公紅斌，黃濤，謝蘇，邱梅玉

(石河子大學動物科技學院， 新疆 石河子 832000)

環狀RNA(circRNAs)是一種能夠形成共價閉合連續環的RNA[1-2]。circRNA大部分是非翻譯的，可出現在任何基因組區域，包括攜帶基因的區域和基因間區域，長度范圍從幾百到幾十億的核苷酸[3]。作為一種具有閉環結構，沒有5′和3′末端的非編碼RNA(ncRNA)[4-5]，它在許多生物體中廣泛存在，并表現出明顯的組織特異性[6-10]。許多研究發現，circRNA通過microRNA反應元件(MRE)與miRNA結合，充當miRNA海綿競爭性地抑制miRNA在轉錄后調節下游靶基因的表達[11-12]。

circRNA在疾病發生過程中表現出重要的作用，其良好的物種保守性及組織特異性，再加上高度穩定性，使其在作為疾病診斷標記物上具有明顯的優勢[13]。circRNA作為miRNA-7、miR-17和miR-214的海綿提高體內E3泛素(Ub)蛋白連接酶(ITCH)的表達水平，而ITCH的過表達可促進泛素化和Dishevelled 2 (Dvl 2)的磷酸化降解，從而抑制Wnt/β-catenin信號通路[14]。Liu等[15]在骨關節炎細胞中發現，circRNA-CER可充當miR-136的分子“海綿”調控其靶基因MMP13的表達，從而影響軟骨胞外基質(ECM)的形成，進而造成軟骨退化。近年來的研究報道顯示，外顯子circRNA亦可作為miRNA海綿體或是競爭內源性RNA在哺乳動物中起作用[16]。此外,環狀RNA在調控RNA轉錄和蛋白質合成上也可能具有關鍵性的作用[17]。最新研究發現,circRNA還具有存儲、定位RNA結合蛋白的功能[18]。

目前關于circRNA在動物繁殖中的調控作用研究較少。Jiang等[19]研究發現，hsa_circ_0004904和hsa_circ_0001855 mi RNA海綿介導的妊娠相關血漿蛋白A(PAPP-A)的表達，可作為妊娠20周前先兆子癇(PE)的潛在生物標志物。Yan等[20]通過新一代測序(NGS)對產生妊娠期糖尿病(GDM)和正常對照的無偏胎盤絨毛circRNA表達譜進行分析，發現227個circRNA顯著上調，255個circRNA顯著下調，表明circRNA在GDM中發揮著重要的糖代謝和脂代謝作用。Talhouarne等[21]在熱帶非洲爪蟾卵母細胞的細胞質和細胞核中檢測到數千個來自大多數表達基因內含子的穩定RNA(sisRNAs)，其豐度從胚胎發育階段到胚胎發育的胚泡階段保持一致。此外，Fan等[22]運用單細胞通用聚(A)非依賴性RNA測序(SUPe R-seq)技術檢測小鼠卵母細胞和早期胚胎(來自受精卵的囊胚)中發現2 891個circRNA，大多數小于2 kb的circRNA來自同一宿主基因的內部外顯子。

本研究利用生物信息學方法篩選梅山豬與杜洛克豬M2卵泡中差異表達極顯著的circ0010513，通過qRT-PCR檢測差異表達的circRNA，并利用circRNA-miRNA-mRNA調控網絡分析預測其可能的調控機制，為進一步探究circRNA在豬卵泡發育過程中的表達情況奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗樣品采集

試驗選取同一胎次、發情正常、繁殖表現符合品種特征的梅山和杜洛克成年母豬各3頭，以發情出現靜立反應時記做發情周期第0天，發情周期第14天沿耳緣靜脈注射獸用氯前列烯醇注射液1支/頭，注射后第4天屠宰取不同級別卵泡樣，按直徑分類(M1卵泡：3.1～5.0 mm；M2卵泡5.1～7.0 mm)于液氮中凍存，同時取心、肝、脾、肺、腎、下丘腦、垂體、卵巢、輸卵管、子宮和子宮角等組織，用錫紙包裹于液氮速凍后于-80 ℃保存備用。

1.2 主要試劑與儀器

TRIzol購自Invitrogen(貨號：10296010)； PrimerScriptTMRT regagent Kit購自寶生物(Takara，貨號：RR047A)；LightCycler 480 SYBR Green I購自Roche (貨號：04887352001)。CyclerTMThermal Cycler PCR 儀購自BIO-RAD；DKB-501A型超恒溫水浴鍋購自上海精宏實驗設備有限公司；DYY-6B 型穩壓穩流電泳儀購自北京六一儀器廠。

1.3 總RNA提取與cDNA合成

取兩品種豬的M2卵泡和不同組織100 mg于液氮中研磨，TRIzol法分別提取樣本總RNA，用1.5%瓊脂糖凝膠電泳驗證總RNA的完整性，NanoDrop 2000檢測濃度及純度，-80 ℃保存備用；反轉錄成cDNA參照TaKaRa反轉錄試劑盒說明書。對部分總RNA進行RNase R(Epicenter, 貨號：RNR-07250)消化處理，并用RNA clean up(QIAGEN 公司，貨號：217004) 商品試劑盒對 RNA 進行回收，-80 ℃保存備用。

1.4 引物設計與合成

挑選差異表達的 circ0010513，設計特異性擴增反向剪切位點的引物，由新疆烏魯木齊昆泰銳公司合成(表1)。

表1 circ0010513及內參引物序列

1.5 circ0010513 熒光定量PCR擴增

采用Deseq 2進行circRNA差異表達分析，比較梅山與杜洛克豬組，以|Fold Change|≥1.5和P<0.05作為差異表達閾值，并選取鑒定差異表達的circRNA。

反應體系：SYBR?Green I PCR Mix 10 μL，上下游引物各1μL；cDNA模板2 μL；加dd H2O至20 μL。反應條件為：94 ℃變性5 min，35次循環(94 ℃，30 s；54 ℃，30 s；72 ℃，30 s；72 ℃，5 min)。分別對梅山與杜洛克豬各3個樣本進行qRT-PCR試驗，每個試驗重復3次，取平均值作為分析所用數據。

1.6 circ0010513靶基因預測及功能分析

利用miRanda(http://miranda.org.uk/)、RNAhybrid(http://bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de/rnahybrid)和targetscan(http：//www.targetscan.org)靶基因預測軟件對circ0010513的靶基因進行分析預測，并通過DAVID軟件和KOBAS軟件分別對circ0010513的靶基因進行GO和KEGG分析。

1.7 數據處理

分析各組織及梅山豬和杜洛克豬各級卵泡中circ0010513的相對表達量，利用SPSS 19.0軟件對數據進行分析，數據以“平均值±標準誤”表示，樣本間差異顯著性進行t檢驗或方差分析，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結果

2.1 circRNA鑒定

通過瓊脂糖凝膠電泳分析qRT-PCR產物，擴增出circ0010513的反向剪切位點(圖1)。回收PCR產物并送上海生工生物工程有限公司測序，測序結果表明，所測片段與目的片段大小一致,進一步驗證了擴增結果的準確性(圖2)。

M.為DNA Maker DL 600；1～4. circ0010513擴增產物

圖2 circ0010513首尾鏈接序列測序峰圖

2.2 circ0010513在不同組織中的表達分析

通過qRT-PCR對circ0010513在杜洛克豬組織中的表達量分析，結果顯示其在心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、下丘腦、垂體、卵巢、輸卵管、子宮和子宮角中均有不同程度的表達(圖3)，表明circ0010513在不同組織中的表達具有明顯的組織特異性。

圖3 circ0010513在杜洛克豬不同組織中相對表達量

2.3 circ0010513在不同時期卵泡中的表達

運用qRT-PCR檢測梅山與杜洛克豬不同級別卵泡中circ0010513的表達情況(圖4)。circ0010513在梅山豬中M1卵泡的表達量極顯著高于M2卵泡(P<0.01)，在杜洛克豬中M2卵泡中的表達量顯著高于M1卵泡(P<0.05)；梅山豬的M1卵泡中的表達量極顯著高于杜洛克豬的M1卵泡(P<0.01)，梅山豬M2卵泡中的表達量極顯著高于杜洛克M2卵泡(P<0.01)，揭示梅山豬具有較高的排卵。

注：同一品種不同時期比較,*表示差異顯著，P<0.05；**表示差異極顯著,P<0.01；不同品種不同時期比較，不同大寫字母表示差異極顯著，P<0.01。下同

2.4 circ0010513靶基因預測及GO和KEGG分析

利用miRanda、 RNAhybrid和targetscan進行circ0010513靶基因預測，發現circ0010513-ssc-miR-1343-GADD45G這一調控網絡途徑可用于后續研究(表2)。

表2 circ0010513靶基因預測

此外，對circ0010513進行GO和KEGG通路富集分析，circ0010513的靶基因參與凋亡(GO:0006915)、MAP激酶酪氨酸/絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶活性(GO:0017017)、細胞因子受體活(GO:0004896)和細胞周期調控(GO:0051726)等生物學過程(圖5)。KEGG通路分析發現circ0010513參與動物繁殖調控的多條通路，如FoxO信號通路(ssc04068)，MAPK信號通路(ssc04010)和細胞周期信號通路(ssc04110)等。

2.5 circRNA-miRNA-mRNA調控網絡構建

將高通量測序結果進行篩選，對具有較多miRNA結合位點的差異表達ssc-circ0010513進行miRNA及靶基因進行預測(圖6)，分析測序結果發現，circ0010513-ssc-miR-1343-DUSP5與circ0010513-ssc-miR-328-LAMB3可能參與豬的妊娠調控過程。

圖5 GO富集分析

注：紅色表示circ0010513；黃色表示miRNA；綠色表示靶基因

3 討論

由于高通量測序技術和生物信息學的進步，一度被認為是剪接錯誤的副產物circRNA，最近被發現在人類細胞中廣泛表達并在許多生物過程中發揮作用[23-24]。雖然，circRNA通常被分為一類ncRNA，最近的研究表明，circRNA可以翻譯成蛋白質可以豐富circRNAs在生命活動中的關鍵作用[25-26]。

Li等[27]研究發現在大白豬和萊蕪豬皮下脂肪組織中鑒定出275個差異表達的circRNA。其中，萊蕪豬皮下脂肪組織中70個上調，205個下調。研究人類唾液中circRNA發現其可能具有細胞外功能，甚至可以作為此類樣本中的生物標記物[28]。研究發現，通過檢測癌癥細胞外泌體中的circRNAs并結合circRNAs在心血管病、癌癥等疾病中差異性表達的特征，提示其或許可作為臨床疾病診斷的生物標志物[29]。

生長阻滯和 DNA 損傷誘導蛋白45γ(Growth arrest and DNA-damage-inducible protein GADD45 gamma，Gadd45g) 是GADD45 蛋白家族三成員之一，也叫做細胞因子應答基因，可影響細胞周期，負調控細胞生長[30-31]。Gadd45g是抑制了STAT3的磷酸化，促進了胚胎干細胞中內胚層的分化[32]。Lu等[33]研究發現氧化應激(OS)在女性生殖和女性生殖疾病中的發揮作用，包括多囊卵巢綜合征(PCOS)，子宮內膜異位癥，子癇前期等。而Keap1-Nrf2，NF-κB，FoxO和MAPK通路也受OS的影響，影響生殖及生殖疾病。

本研究通過高通量測序檢測梅山豬和杜洛克豬M2時期卵泡中的circRNA，發現circ0010513在兩品種中差異極顯著，后期通過qRT-PCR驗證與高通量測序結果一致，進一步證明了測序結果的準確性。此外，通過構建circRNA-miRNA-mRNA調控網絡預測得到其潛在靶基因DUSP5和IL20RB，其可能通過MAPK信號通路和JAK STAT信號通路之間的關聯相互作用影響細胞的增殖、分化及凋亡等；LAMB3參與了PI3K-Akt信號通路調控哺乳動物卵巢發育[34-35]；靶基因GADD45G參與細胞周期及卵巢發育相關通路如FoxO信號通路可能參與了卵泡發育及排卵過程。因此circ0010513-ssc-miR-1343-DUSP5與circ0010513-ssc-miR-328-LAMB3可能參與調控豬卵泡發育，這將為進一步研究其調控作用機制提供理論依據。

4 結論

本試驗通過高通量測序技術檢測梅山豬和杜洛克豬M2時期卵泡中的circRNA，運用miRanda、RNAhybrid和Targetscan篩選，發現circ0010513在兩品種中差異極顯著與測序結果趨于一致。進一步構建circ0010513-miRNA-mRNA調控網絡，發現circ0010513-ssc-miR-1343-DUSP5與circ0010513-ssc-miR-328-LAMB3可能參與調控豬卵泡發育，進而影響豬的繁殖性能。