豬SUMO1基因的堿基序列特征及其在豬肺炎支原體感染過程中的表達

王麗 楊曉陽 曹靜 趙為民 涂楓 付言峰 李碧俠 陳哲 任守文 方曉敏

摘要：根據NCBI 上GenBank 的豬類泛素蛋白修飾分子1（SUMO1）基因堿基序列（NM_001112676.1），設計編碼區全長上、下游引物，成功克隆了豬SUMO1基因完整的編碼區序列。經生物信息學軟件分析發現豬SUMO1基因的蛋白質編碼區（CDS） 全長306 bp，編碼101個氨基酸，SUMO1 的蛋白質氨基酸序列在物種間高度保守。SUMO1基因在豬心、肝、脾、肺、腎、小腸及肌肉組織中均有表達，且在肺部表達較高。豬肺炎支原體感染原代豬肺泡巨噬細胞后SUMO1的mRNA表達水平顯著升高。參與調控炎癥反應的基因，如TLR2、P65和RXRα均存在潛在的SUMO化修飾位點，并且豬肺炎支原體感染后它們的mRNA表達水平極顯著升高。

關鍵詞：豬肺炎支原體;SUMO1;豬肺泡巨噬細胞;炎癥反應

中圖分類號：S858.286.3文獻標識碼：A文章編號：1000-4440（2020）05-1229-08

Abstract：The full-length upstream and downstream primers of SUMO1 （the gene of small ubiquitin-like modifier 1） were designed according to the base sequence of SUMO1 gene （NM_001112676.1） of GenBank on National Center for Biotechnology Information（NCBI） and the whole CDS（coding sequence） of porcine SUMO1 National Center for Biotechnology Information gene was cloned successfully. The results of bioinformatics software analysis showed that porcine SUMO1 gene-related protein CDS was 306 bp in length， encoded 101 amino acids and the amino acids sequence of SUMO1 protein was highly conserved among species. SUMO1 gene was expressed in porcine heart， liver， spleen， lung， kidney， small intestine and muscle， among which the relative expression of SUMO1 was higher in lung than in other tissues. After Mycoplasma hyopneumoniae infection， the mRNA expression level of SUMO1 was significantly increased in primary porcine alveolar macrophages. The potential SUMO modification sites were found in TLR2， P65 and RXRα genes， which participated in the regulation of inflammatory response. In addition， their mRNA expression levels were significantly up-regulated after Mycoplasma hyopneumoniae infection.

Key words：Mycoplasma hyopneumoniae;small ubiquitin-like modifier（SUMO1）;porcine alveolar macrophages;inflammatory response

豬支原體肺炎，是由豬肺炎支原體（Mycoplasma hyopneumoniae， Mhp）感染引起的存在于各年齡段豬中的慢性接觸性呼吸道傳染病[1]。Mhp具免疫抑制和免疫逃避的特性，使該病難根治，需要長期消耗性的治療，并且容易繼發感染其他呼吸道相關病毒而造成死亡，是養豬業主要疫病之一[2-3]。近年來針對Mhp的致病機理和免疫防御等的研究取得了顯著進展，但Mhp的耐藥菌不斷地出現，候選基因也不明確[4]，其致病的分子機制研究相對還很缺乏，特別是對宿主炎癥反應的調控機制以及如何誘導免疫抑制等問題尚未得到完全解析。

SUMO化修飾是一種高度動態可逆的類泛素化修飾方式，通過與多種底物的供價結合發揮功能。哺乳動物中已發現4種SUMO蛋白，即SUMO1、SUMO2、SUMO3和SUMO4，其中SUMO1與SUMO2和SUMO3的同源性只有50%左右[5]。SUMO化位點的預測主要是利用生物信息學與氨基酸位點定向誘變和基于質譜（MS）的蛋白質組學分析，蛋白質中存在SUMO修飾的保守序列ψKXE/D（ψ為疏水性氨基酸，X為任意氨基酸），則其中的賴氨酸是可能的SUMO修飾位點 [6]。SUMO蛋白可以調節蛋白質與蛋白質或DNA之間的相互作用，從而調控轉錄因子的活性;SUMO蛋白可以與泛素競爭性結合賴氨酸，從而維持靶蛋白的穩定性;介導蛋白質在核孔的穿梭，調節其在細胞中的定位[7-8]，從而參與各種各樣的生命活動如細胞的增殖分化、基因的表達、細胞器的合成、細胞的凋亡等。

SUMO化修飾參與調節炎癥反應，宿主細胞被病毒感染后容易引起炎癥反應，且其整體SUMO化修飾水平發生了明顯的變化。SUMO蛋白可以對病毒本身的蛋白質或者宿主細胞中的蛋白質進行修飾，影響宿主細胞對病毒的防御能力 [8]。在乳腺癌細胞中SUMO1是調節炎癥反應的關鍵因子，SUMO連接酶TRIM38可以調節先天性免疫和炎癥反應。NEMO被SUMO化修飾后可以加強NF-κB的活性，促進NF-κB依賴性細胞因子的合成以及胰腺炎癥反應[8]。但SUMO化修飾在豬肺炎支原體感染過程中的研究報道甚少。本研究克隆豬SUMO1基因的編碼區序列，對其編碼的氨基酸序列進行生物信息學分析，檢測SUMO1在豬組織中的表達譜，并利用豬肺炎支原體J株感染原代豬肺泡細胞，分析細胞中SUMO1的表達變化規律，并檢測炎癥因子及相關因子的表達水平，為進一步研究類泛素化修飾在豬肺炎支原體感染中的作用機制奠定基礎。

1材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1菌株及主要試劑試驗用豬肺炎支原體為J菌株，由江蘇省農業科學院獸醫研究所饋贈，使用時菌株含量調整為1 ml 1×108CCU[9]。

限制性內切酶、T4連接酶、DNA marker、cDNA 反轉錄試劑盒、pMD19-T、預混PCR試劑盒和SYBR Green Real-time PCR Master Mix 定量PCR試劑盒購自TaKaRa公司，RNA提取和DNA回收試劑盒均購自北京天根生化科技有限公司，青鏈霉素和胎牛血清購自Thermo Fisher公司，RPMI-1640培養基與PBS緩沖液購自Hyclone公司。引物合成和測序均在擎科生物技術有限公司進行。

1.1.2試驗組織樣品試驗用豬心、肝、脾、肺、腎、小腸及肌肉樣品均采自南京六合屠宰場。

1.2方法

1.2.1原代豬肺泡巨噬細胞的分離及培養將豬肺臟取出后，用無菌繩子將氣管結扎，再用清洗液（含雙抗的PBS緩沖液）沖洗肺部表面，并用無菌紗布擦干。向氣管中注入清洗液，每次50～100 ml，并輕輕揉捏肺臟表面，回收灌洗液，并利用70 μm細胞過濾器去除組織塊狀雜質，重復灌洗2～3次。在1 000 r/min轉速下離心10 min，棄掉上清液，利用清洗液重復洗滌3次，最后將獲得的豬肺泡巨噬細胞用含10%血清的RPMI-1640培養液重懸后鋪于細胞培養皿中，置于5% CO2、37 ℃的細胞培養箱。培養1.5～2.0 h后從培養箱中取出培養皿，棄掉舊培養基，并利用清洗液潤洗2～3次后加入預熱的全新培養液培養。

1.2.2豬肺炎支原體感染原代豬肺泡巨噬細胞將豬肺炎支原體J株原液取出后置于離心管中，10 000 r/min離心20 min后棄上清液，再利用PBS懸浮后，10 000 r/min離心20 min后棄上清液，如此清洗1～2次后加入無雙抗的細胞培養基懸浮。將懸液加入鋪有原代豬肺泡巨噬細胞的細胞培養板中進行豬肺炎支原體感染，24 h后收集細胞樣品進行后續處理。

1.2.3SUMO1基因的克隆根據NCBI 上GenBank 的豬SUMO1堿基序列（NM_001112676.1），設計編碼區全長上、下游引物（表1）。PCR 擴增反應總體積為50 μl，包括：預混PCR反應液25 μl，ddH2O 16 μl，上、下游引物各2 μl，cDNA模板 5 μl。PCR 擴增反應條件為：95 ℃ 2 min后，進行33個循環（98 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s， 72 ℃ 30 s），最后72 ℃ 10 min。將PCR 擴增產物參照DNA回收試劑盒說明書進行回收后，與pMD19-T 載體連接，轉化到DH5α大腸桿菌中。37 ℃搖菌1 h后，將渾濁的菌液涂在含有氨芐抗性的固體培養基上，37 ℃培養，正置30 min后倒置12 h左右，隨機挑取3～5個克隆置于液體培養基中搖菌6～8 h，菌液渾濁后測序。將測序正確的菌液進行擴大培養、質粒提取和保存。

1.2.4半定量PCR和實時熒光定量PCR檢測基因表達收集豬不同組織的樣品，提取RNA，濃度和質量測定達標后，反轉錄為cDNA，用半定量PCR 檢測SUMO1在豬7種不同組織中的表達情況。利用表1中SUMO1定量引物和HPRT1內參引物進行PCR擴增， 反應體系總體積為20.0 μl，包括：預混PCR反應液10.0 μl，ddH2O 6.6 μl，上、下游引物各0.5 μl，cDNA 模板2.0 μl。PCR反應條件為：95 ℃ 2 min后，進行35個循環（95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s），最后72 ℃ 10 min。利用Image J軟件分析瓊脂糖凝膠電泳得到的目的條帶的灰度值。

收集經過豬肺炎支原體處理和未處理的豬肺泡巨噬細胞，提取RNA，濃度和質量測定達標后，反轉錄為cDNA。利用表1中目的基因的定量引物和HPRT1內參引物進行熒光定量PCR擴增檢測目的基因mRNA表達水平。反應體系為20 μl，退火溫度為60 ℃，其他條件參照定量PCR 試劑盒說明書，將得到的Ct值采用2-△△Ct方法進行分析。定量PCR中每個樣品3個重復。

1.2.5試驗結果分析及預測軟件試驗中所有數據的差異分析均利用SPSS17.0軟件進行，結果表示為平均值±標準差。利用SUMOsp2.0進行SUMO化位點預測。豬SUMO1蛋白生物信息學分析軟件和網站參照趙為民等使用的分析軟件和網站[10]。

2結果與分析

2.1豬SUMO1基因編碼區的擴增及克隆

提取豬肺臟組織RNA，反轉錄為cDNA后進行PCR擴增，得到SUMO1基因的編碼區全長序列。利用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR 擴增產物，如圖1所示，在大約500 bp附近有單一目的條帶，與預計片段大小516 bp基本相符。經回收、雙酶切、連接、轉化、鋪板、挑菌、搖菌后進行菌液測序驗證，成功克隆了豬SUMO1基因的編碼區，全長為306 bp，起始和終止密碼子分別為ATG和TAG，其中G+C含量為24.6%。

2.2豬SUMO1的蛋白質理化性質分析

2.2.1SUMO1的氨基酸序列分析結果（表2）顯示：豬SUMO1由101個氨基酸組成，包含19種氨基酸。

2.2.2SUMO1的磷酸化位點預測如圖2所示，豬SUMO1的氨基酸序列中存在磷酸化修飾的潛在位點。

2.2.3SUMO1的結構預測及分析分別用NPS@SOPMA和SWISS-MODEL預測SUMO1的二級結構（圖3、表3）和三級結構（圖4）。結果顯示，無規則卷曲、α-螺旋和延伸鏈為SUMO1的二級結構的主要結構，占比達到91.08%，β-轉角占比較小，為8.91%。

SignalP 4.1和TMHMM 2.0軟件預測結果顯示， SUMO1沒有信號肽，也不存在跨膜結構，這符合SUMO1作為修飾性非分泌小分子蛋白質的特性。

2.2.4SUMO1的系統進化樹分析在NCBI中查找了8 種代表性動物的SUMO1氨基酸序列，比對分析結果（圖5）顯示，預測的豬SUMO1氨基酸序列（NP_001106146.1）與人（NP_001005781）、小鼠（NP_033486.1）、大鼠（NP_001009672.1） 、豬（NP_001106146.1）、牛（NP_001030535.1）、獼猴（NP_001182571.1）和狗（NP_001239192.1）的SUMO1氨基酸序列相似性均為100%，而與雞（NP_989466.1）的SUMO1氨基酸序列相似性也達到98%。系統進化樹（圖6）顯示，豬SUMO1蛋白在進化中與其他6種哺乳動物的SUMO1蛋白聚為一大類，而雞的SUMO1蛋白單獨為一類。

2.3SUMO1在豬不同組織中的表達譜

利用豬不同組織的cDNA樣品進行PCR擴增，檢測結果如圖7A所示，在 182 bp 處得到預期的單一SUMO1基因目的條帶，以及單一的內參基因HPRT1條帶。對組織表達譜的各個條帶進行灰度值分析后得到圖7B中的相對表達量，其中SUMO1在心、肝、脾、肺、腎、小腸及肌肉組織中均有表達，且在肺組織中表達量相對較高，推測其參與調控肺組織的生理功能。

2.4豬支原體肺炎感染原代豬肺泡巨噬細胞后SUMO1的mRNA表達水平

利用豬支原體肺炎J株對原代豬肺泡巨噬細胞進行感染處理24 h后，檢測SUMO1的mRNA表達水平。結果顯示豬肺炎支原體感染后SUMO1在原代豬肺泡巨噬細胞中的表達水平顯著升高（圖8），表明SUMO1的修飾作用可能參與豬肺炎支原體的感染。

2.5調控炎癥反應因子表達的上游調控基因SUMO化修飾位點預測

在NCBI上查找到TLR2、NF-κB和RXRα的氨基酸序列，并利用SUMOsp 2.0軟件分析預測它們可能的SUMO化修飾位點。結果如表4所示，TLR2、NF-κB和RXRα均存在潛在的SUMO化修飾位點，并均含有經典的SUMO修飾序列。

2.6豬支原體肺炎感染原代豬肺泡巨噬細胞后相關調控基因的mRNA表達水平

豬肺炎支原體感染原代豬肺泡巨噬細胞24 h后檢測相關調控因子的表達情況，結果顯示TLR2、P65和RXRα的mRNA表達水平均極顯著性上調（圖9）。

3討論

豬肺炎支原體感染機體會造成細支氣管和血管周圍的巨噬細胞和淋巴細胞發生單核細胞浸潤，引起炎癥因子的表達和炎癥反應[11-13]。將豬的免疫器官胸腺切除后，再接種豬肺炎支原體，其肺炎癥狀較未切除胸腺的豬輕，表明在豬支原體肺炎致病過程中免疫系統發揮著關鍵作用[14]。本研究分離培養了原代豬肺泡巨噬細胞，利用豬肺炎支原體J株進行感染，發現炎癥因子IL-6及IL-8的mRNA表達水平極顯著上調，說明豬肺炎支原體感染也會引起細胞水平的炎癥反應。利用半定量PCR檢測了SUMO1在豬不同組織中的表達譜，發現SUMO1在豬心、肝、脾、肺、腎、小腸及肌肉中均有表達，且在肺部SUMO1的表達量較其他組織高，說明SUMO1可能參與調控肺組織的生理功能。

為了研究豬SUMO1在肺組織中的功能，本研究首先克隆了豬SUMO1基因的堿基序列，其次利用生物信息學分析軟件及網站預測分析了其基本屬性。發現豬SUMO1基因的編碼區長為306 bp，可以編碼101個氨基酸。分析了8種不同物種，發現SUMO1蛋白氨基酸序列在它們中的相似度高達98%以上。系統進化樹分析結果顯示豬SUMO1蛋白與其他6種哺乳動物的SUMO1蛋白聚為一類，而卵生動物雞單獨為一類。這表明作為蛋白質翻譯后修飾的蛋白質分子，SUMO1氨基酸序列在物種間高度保守以保證其功能的保守。

機體的炎癥反應受多種因子的調節，Toll樣受體家族成員在先天性和適應性免疫引起的炎癥反應中作為固有模式識別受體發揮著重要作用，其中TLR2的報道甚多，它可以激活先天性免疫反應，啟動炎癥反應[15-16]。在敲除TLR2后機體過敏性炎癥反應會減輕[17]。TLR2可以調控NF-κB參與抗菌肽抵抗細菌對機體的侵襲，而NF-κB可以調控RXRα等核轉錄因子參與炎癥反應的發生[9]。雖然TLR2、NF-κB和RXRα均參與機體的炎癥反應調控，但它們在豬肺炎支原體感染過程中的作用還不明確。本研究發現豬肺炎支原體感染后原代豬肺泡巨噬細胞中這些調控基因（TLR2、NF-κB和RXRα）的表達水平均顯著性上調。利用SUMOsp 2.0軟件預測分析后發現這些調控因子均存在潛在的SUMO修飾位點。進一步分離培養原代豬肺泡巨噬細胞后利用豬肺炎支原體感染，發現SUMO1的表達水平顯著升高，推測SUMO1在豬肺炎支原體感染過程中參與炎癥反應的發生。

SUMO化修飾能通過直接或間接的方式影響NF-κB和RXRα的功能。在肺癌細胞中SUMO1與NF-κB的表達呈顯著正相關關系，過表達SUMO1后NF-κB的表達水平顯著上調，干擾SUMO1后NF-κB的表達水平顯著下調[18]。這與乳腺癌細胞中去SUMO化蛋白SENP2可以抑制NF-κB的活化相符合[19]。利用LPS、IL-1β、TNFα誘導肝癌細胞產生炎癥反應時，RXRα的K108殘基可以被SUMO化修飾，并影響其下游基因的表達，其中LPS和IL-1β處理細胞后能誘導RXRα被SUMO1蛋白修飾，而TNFα處理后可以誘導RXRα被SUMO1和SUMO2蛋白修飾[20]。本研究中發現SUMO1與TLR2、NF-κB和RXRα的表達呈現正相關關系，有待進一步驗證豬肺炎支原體感染過程中SUMO1通過調控TLR2、NF-κB和RXRα的功能參與調控豬肺炎支原體感染引起的炎癥反應的推測。

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（責任編輯：張震林）