甘氨酸通過PTEN/Akt通路減輕腦出血大鼠神經損傷

韓鮮艷，張 芾，孫貴祥

(如皋市人民醫院神經內科，江蘇 南通 226500)

腦出血是腦卒中最嚴重的一種亞型，具有高發病率、高致殘率和高致死率，嚴重威脅著人們的身體健康，給家庭和社會帶來了沉重的經濟負擔[1]，目前還沒有好的方法可以提高腦出血患者的生存率并改善其生活質量。甘氨酸作為一種非必需氨基酸在細胞代謝過程中發揮著非常重要的作用。

甘氨酸是一種神經遞質抑制劑，通過與甘氨酸受體的結合抑制突觸后神經元的活動。有研究發現，甘氨酸在缺血再灌注、缺氧、低氧以及活性氧造成的腦組織神經損傷的疾病中具有神經保護作用[2-4]。本實驗旨在探討甘氨酸對腦出血造成的神經損傷的作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

甘氨酸(美國sigma公司)，磷酸酶與張力蛋白同源物基因(phosphatase and tensin homologous gene，PTEN)多克隆抗體(美國Millipore公司)，蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)多克隆抗體(美國Millipore公司),β-actin抗體(美國Millipore公司),羊抗鼠/兔IgG(北京中杉金橋生物技術有限公司)，伊文思藍染液(美國Invitrogen公司)，RNA提取試劑盒，反轉錄試劑盒(美國Illumina公司)。超聲破碎儀(上海歐河機械設備有限公司)，穩壓穩流電泳儀(北京六一儀器廠)，立體定定位儀(美國Thermo Scientific公司)，PCR反應擴增儀(美國Bio-Rad公司)。

1.2 實驗動物及分組

SPF級SD大鼠，雄性，280～300 g，48只，由中國醫科大學動物實驗中心提供，保持室溫在(25±2) ℃，相對濕度(55±10)%，12 h的晝/夜循環，大鼠可以自由的攝入食物和水。側腦室注射自體血建立大鼠腦出血模型并稱取體質量編號后，采用隨機數字表法將大鼠分為假手術組、模型組、甘氨酸0.5 mg/kg組和甘氨酸2 mg/kg組，每組各12只。

1.3 方法

1.3.1 腦出血模型的制備 按照Rosenberg法進行大鼠腦出血模型的建立[5]：用10%的水合氯醛對大鼠進行麻醉，將大鼠固定在立體儀上，局部消毒后，于頭部正中縱向切口，使骨膜剝離，于前囪之前2.0 mm、中線右側3.0 mm處鉆孔(1 mm)，用微量進樣器取大鼠股動脈血適量，借助立體定位儀從鉆孔處垂直進針與右側尾狀殼核處，注入80 μL血液，留針10 min后撤針，縫合，消毒。假手術組步驟同上，但是不注入血液。

術后清醒的大鼠按照Zeal Longar 5級評分法判斷腦出血模型的建立是否成功。0分：無明顯神經病學癥狀；1分：不能完全伸展左前肢；2分：向左側旋轉；3分：行走時向左側傾倒；4分：不能自行行走，有意識障礙。累計1分以上即判定為造模成功。造模第二天，甘氨酸0.5 mg/kg組和甘氨酸2 mg/kg組側腦室注射甘氨酸，給藥劑量分別為0.5 mg/kg和2 mg/kg[6-7]，假手術組和模型組側腦室給等量的生理鹽水,給藥后48 h處死。

1.3.2 腦組織含水量的測定 每組隨機取4只大鼠，麻醉后斷頭處死，取大鼠的腦組織，稱重，記為濕重。然后將大鼠的腦組織置于100 ℃的烘箱中72 h，再稱重，記為干重。腦組織含水量(%)=(濕重-干重)/濕重×100%。

1.3.3 血腦屏障通透性檢測 每組隨機取4只大鼠，尾靜脈注射2%伊文思藍染液(evans blue dye，EB，5 mL/kg),2 h后水合氯醛麻醉，左心室灌流。取大鼠的腦組織，稱重，加入適量的甲酰胺，60 ℃水浴24 h，勻漿后1 000 r/min離心10 min，取上清液，635 nm波長處檢測吸光度，計算EB含量。

1.3.4 血腫塊體積檢測 取剩余4只大鼠腦組織，準備好連續的血腫塊冠狀切片后，拍照，然后用Image J軟件測量血腫塊體積。

1.3.5 TUNEL染色法檢測腦組織細胞凋亡的情況 取實驗2.2.4中大鼠腦組織，將大鼠腦血腫組織做成石蠟切片，過氧化氫(3%)室溫孵育5 min，檸檬酸鹽(0.01 mol/L)100 ℃修復10 min，BSA(5%)室溫封閉1 h，TUNEL(1∶500)室溫孵育90 min,熒光素抗體(1∶500)37 ℃孵育60 min，Hoechst室溫孵育5 min，封片，熒光顯微鏡觀察。

1.3.6 Real-timePCR檢測大鼠腦組織Akt mRNA和PTEN mRNA的表達 取適量大鼠腦組織，液氮研磨后加入適量的Trizol提取RNA，根據Prime Script RT試劑盒說明書進行反轉錄，根據SYBR Premix Ex TaqTMII試劑盒說明書進行PCR操作。采用相對定量的方法計算樣本間的相對百分比。△△Ct=(Ct目的基因-Ct內參基因)實驗組-(Ct目的基因-Ct內參基因)對照。目的mRNA的量=2-ΔΔCt。

表1 引物序列

1.3.7 Western blot檢測PTEN蛋白和Akt蛋白的表達水平 取適量大腦組織加入適量的含PMSF的RIPA裂解液，用超生破碎儀裂解，4 ℃離心(12000 g,10 min)，取上清液，用BCA試劑盒測蛋白濃度，然后加入適量的上樣緩沖液，沸水浴變性。將各組蛋白加入到12%的SDS-聚丙烯酰胺凝膠中電泳，電泳完畢后轉膜，PVDF膜用1∶1 000的PTEN、Akt和β-actin抗體進行孵育。二抗的稀釋比例為1∶4 000，然后用凝膠成像分析儀顯影，用ImageJ進行半定量分析。

1.4 統計學方法

2 結 果

2.1 大鼠腦組織含水量、EB含量、腦腫塊體積

4組大鼠腦組織含水量、EB含量比較見表2。與假手術組比較，模型組腦組織含水量、EB含量升高。與模型組比較，甘氨酸2 mg/kg組腦組織含水量、EB含量顯著性降低。與甘氨酸0.5 mg/kg組比較，甘氨酸2 mg/kg組腦組織含水量、EB含量顯著降低。與假手術組比較，模型組腦腫塊體積明顯增大，與模型組比較，給予腦甘氨酸干預后顯著性降低，其中甘氨酸2 mg/kg組腦腫塊體積降低顯著。

表2 各組大鼠腦組織含水量、EB含量及腦腫塊體積的比較

2.2 各組大鼠腦組織細胞凋亡情況

與假手術組比較，模型組大鼠腦組織凋亡細胞數量顯著升高；與模型組比較，給予甘氨酸后，凋亡細胞的數量降低，而且隨著給藥劑量的增加，凋亡細胞的數量進一步降低，見圖1。

圖1 甘氨酸對ICH后腦組織細胞凋亡的影響(200×)A：假手術組；B：模型組；C：甘氨酸0.5 mg/kg組；D：甘氨酸2 mg/kg組

2.3 大鼠腦組織Akt mRNA、PTEN mRNA的表達水平

4組大鼠腦組織Akt mRNA、PTEN mRNA表達水平比較見表3。與假手術組比較，模型組Akt mRNA表達水平降低，PTEN mRNA表達水平升高。與模型組比較，甘氨酸可升高Akt mRNA表達水平，降低PTEN mRNA表達水平，其中2 mg/kg甘氨酸最為顯著。

表3 各組腦組織Akt mRNA、PTEN mRNA的表達水平比較

2.4 大鼠腦組織Akt蛋白、PTEN蛋白表達水平

4組腦組織Akt、PTEN蛋白表達水平比較見圖2和表4。與假手術組比較，模型組Akt、p-Akt蛋白水平降低,PTEN蛋白水平升高。與模型組比較，甘氨酸可升高Akt、p-Akt蛋白水平,降低PTEN蛋白水平，其中甘氨酸2 mg/kg作用最為顯著。

圖2 各組大鼠腦組織Akt蛋白、PTEN蛋白的表達A：假手術組；B：模型組；C：甘氨酸0.5 mg/kg組；D：甘氨酸2 mg/kg組

3 討 論

甘氨酸作為結構最簡單的非必需氨基酸，參與機體很多的病理生理學過程。在中樞神經系統中甘氨酸可以作為神經遞質參與信號的傳遞[8]。PTEN/Akt信號通路在細胞增殖、分化和凋亡等過程中發揮著非常重要的作用[9]。PTEN是人的第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源的基因，主要的作用底物是PIP3，使其脫磷酸變成PIP2，從而抑制Akt的激活，抑制細胞的分裂，最終造成細胞凋亡[10]。而PTEN的突變或者缺失會造成Akt的激活，活化的Akt可以調節細胞的轉錄因子，降低細胞凋亡的發生，使蛋白質的表達水平升高從而促進細胞分裂、轉化、遷移以及代謝[11]。

本實驗發現，與假手術組比較，模型組PTEN蛋白及mRNA的表達顯著性升高，而Akt蛋白及mRNA的表達顯著性的降低，給予甘氨酸干預后，PTEN蛋白和mRNA的表達水平降低，Akt蛋白和mRNA的表達升高。此外，模型組腦組織中凋亡細胞的數量顯著升高，給予甘氨酸干預后凋亡細胞的數量降低，這可能是由于甘氨酸通過下調PTEN基因的表達，使Akt活性增強，間接抑制下游凋亡基因的表達，從而使神經細胞的凋亡受到抑制，發揮保護神經組織的作用。有研究也發現，在缺氧缺糖造成的大鼠神經損傷的模型中，甘氨酸可以通過抑制PTEN的表達發揮神經保護的作用[12]。

腦出血不僅通過直接的機械作用導致原發性腦損傷，也會引起繼發性的腦損傷例如血腦屏障通透性的破壞。血腦屏障的破壞引發腦水腫，進而引起神經組織的損傷以及細胞凋亡，加重細胞功能障礙和壞死[13]。腦水腫使腦組織液體增多致使腦容積變大，根據血腦屏障是否受到破壞，可以將腦水腫分為血管源型水腫以及細胞毒性水腫。本實驗研究發現，模型組大鼠腦組織血腦屏障通透性降低，腦水腫情況加劇，甘氨酸干預后，大鼠腦組織血腦屏障通透性升高而且腦水腫減輕，由此可見，甘氨酸具有較好的保護腦組織的作用。

綜上所述，甘氨酸能夠通過抑制PTEN的表達從而導致Akt的激活，進一步抑制下游凋亡基因的表達，從而減輕腦細胞凋亡、降低血腦屏障通透性、減輕腦水腫，發揮神經保護的作用。