長鏈非編碼RNA對肝纖維化的調控作用

盧能源， 鐘芳菲， 鄧青梅， 楊研琪， 鄭 洋， 趙鐵建,b， 梁天堅

廣西中醫藥大學 a. 賽恩斯新醫藥學院； b. 基礎醫學院生理教研室， 南寧 530021

肝纖維化是機體對于膽汁淤積、病毒性肝炎、慢性酒精中毒等病因所致持久肝損傷而反饋出的一種自我修復反應。其本質是以膠原蛋白為主要成分的細胞外基質(ECM)的降解減少，而合成相對增加，兩者失衡，從而導致過多的ECM積聚于肝臟內，引發肝纖維化[1]。ECM主要由持續處于活化狀態的肝星狀細胞(HSC)分泌[2]。肝纖維化發生時，眾多的致纖維化因素會不斷地刺激HSC，使其激活并轉化為成纖維細胞，并大量分泌ECM、生長因子以及趨化轉化因子，且還使α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)的水平顯著增多以作為HSC被激活的標志[3]。近年來大量研究[4]顯示，長鏈非編碼RNA(lncRNA)可作為競爭性內源RNA(competitive endogenous RNA，ceRNA)與微RNA( microRNA，miRNA)結合，進而調控下游的Wnt、Notch等多條信號通路來影響HSC的活化[5]，間接地調控肝纖維化的發展進程。上述研究表明lncRNA有望作為標志物和治療靶標被用來診斷、治療肝纖維化。本文就lncRNA通過充當ceRNA而對肝纖維化發揮調控作用的最新研究進展作一綜述。

1 LncRNA概述

1.1 lncRNA的定義及特點 lncRNA是一種轉錄本長度超過200 nt的RNA分子，多數于細胞核、細胞漿內被發現，約占lncRNA的80%。據報道[6]，絕大多數的lncRNA都來源于RNA聚合酶Ⅱ的轉錄，部分經過剪接后具有5′帽子結構和3′端多聚腺嘌呤尾巴，結構與編碼蛋白質的信使RNA(mRNA)類似。與mRNA不同的是，lncRNA具有較低的保守性和時空表達特異性。由于lncRNA沒有開放的閱讀框，所以其無法編碼蛋白質，或者個別雖有開放閱讀框，但閱讀框很小，僅能編碼100個氨基酸以內的小多肽[7]，如lncRNA LINC00961[8]。其實類似于這種包含小的開放閱讀框且能編碼功能性肽的暫時被假定為lncRNA的序列，可能歸類于編碼 RNA更合適[9]。由此看來，lncRNA的編碼能力遠比之前想象的要繁瑣復雜，繼續深入研究以完善對其編碼能力這方面的認知顯得十分重要。

1.2 lncRNA的分類 由于目前對lncRNA來源、功能等多方面的探索尚未完全，所以目前并無統一的lncRNA分類依據。Wang等[10]將lncRNA的眾多功能提煉為四種分子機制，即按照lncRNA的功能將其分為四種類型的分子，分別為信號型分子、誘餌型分子、指南型分子以及骨架型分子。Dhanoa等[11]指出，可根據編碼基因與lncRNA的相對位置和方向，將其初步分為：正義鏈lncRNA、反義鏈lncRNA、雙向lncRNA、內含子lncRNA以及基因間長鏈非編RNA(long intergenic non-coding RNA，lincRNA)。Sanbonmatsu等[12]指出，未來可能會根據lncRNA的二級結構將其直接分為三種類型，分別是具有子域和復雜結構圖案的高度結構化的RNA分子、具有多個莖環結構而缺乏子域和復雜圖案的結構松散的RNA分子、缺乏二級結構而無子域無圖案的RNA分子。

1.3 lncRNA的生物學功能 lncRNA參與多種病理進程和生物學功能，如惡性腫瘤、細胞的增殖、分化以及凋亡[13]。lncRNA可以通過靶向轉錄因子、直接甲基化復合物、啟動染色質重塑和阻斷附近基因的轉錄等形式來影響細胞活性及生物途徑[14-15]。在肝纖維化的發展階段，一些lncRNA通過充當ceRNA與miRNA結合，發揮正性或負性調節肝纖維化的作用。

2 肝纖維化相關的lncRNA

據文獻[16]報道，一些熱門的lncRNAs，包括母系表達基因3(maternally expressed gene 3，MEG3)、生長停滯特異轉錄因子5 (growth arrest-special transcript 5,GAS5)[17]、lincRNA-p21[18]，均在肝纖維化小鼠模型或肝纖維化患者肝組織或TGFβ1誘導的LX-2人HSC中表達減少，具有明確的抗肝纖維化作用。與此相反，肺腺癌相關轉錄因子1(metastasis -associated lung adenocarcinoma transcript 1，MALAT1)[19]、轉化生長因子β激活的lncRNA(lncRNA-activated by transforming growth factor beta,lncRNA-ATB)[20]、漿細胞瘤變型異位因子1(plasmacytoma variant translocation 1，PVT1)[21]、同源盒轉錄反義RNA( homeobox transcript antisense RNA，HOTAIR)[22]、lncRNA-H19[23]和小核RNA宿主基因7(small nuclear RNA host gene 7, SNHG7)[24]于肝纖維化小鼠模型或肝纖維化患者肝組織或TGFβ1誘導的LX-2人HSC中表達增加，具有促肝纖維化作用。lncRNA與肝纖維化的相關性主要表現在其促肝纖維化或抗肝纖維化方面[25]。

2.1 具有抗肝纖維化作用的lncRNA

MEG3、GAS5以及lincRNA-p21皆已被證明具有抗肝纖維化作用。這些lncRNA具有相似的特性，如都可以充當ceRNA與相關的miRNA結合，調控下游的信號轉導途徑，抑制HSC的增殖活化，減輕肝纖維化程度。由此看來，上調它們的表達水平有望用于逆轉肝纖維化。

2.1.1 母系表達基因3(MEG3) MEG3定位于人14號染色體q32.3的DLK-DIO3印跡區域，長度約為1.6 kb，是一種母系表達的長鏈非編碼基因。He等[16]研究指出，MEG3可通過p53介導的線粒體凋亡途徑來促使HSC LX-2發生凋亡。此外，MEG3可通過與SMO蛋白相互作用來抑制Hh介導的內皮-間質轉化(EMT)過程；亦可通過海綿化miRNA-212來抑制EMT過程，進而阻止HSC的激活[26]。

2.1.2 生長停滯特異轉錄因子5(GAS5) lncRNA-GAS5定位于人染色體 1q25，長度約4087 bp，含有5′-TOP序列。GAS5可作為抑癌基因來抑制腫瘤的進一步發展，如lncRNA-GAS5表達下調于膀胱癌[27]、腎細胞癌[28]等腫瘤中；其亦可作為致癌基因來促進腫瘤的發生發展，如GAS5表達上調于食管癌[29]等腫瘤中。Yu等[17]通過慢病毒載體調控GAS5過度表達，發現GAS5可作為ceRNA與miRNA-222競爭性結合，使miRNA-222表達減少，細胞周期抑制劑p27的蛋白水平增加，進而體外抑制HSC的增殖、激活。此外，Dong等[30]研究指出，lncRNA-GAS5還可通過充當miRNA-23a的ceRNA并與之結合，抑制miRNA-23a對磷酸酶及張力蛋白同源物(PTEN)的降解作用，阻礙PTEN下游磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)，蛋白激酶B(Akt)，雷帕霉素(mTOR)磷酸化，下調蝸牛哺乳動物靶標(SNAIL)的表達水平，從而抑制PTEN/PI3K/Akt/mTOR/SNAIL途徑，減少α-SMA 和Ⅰ型膠原α1(collagen type I alpha 1，COL1α1)的合成，抑制HSC活化，阻止肝纖維化。提示GAS5/miRNA-222/p27和GAS5/miRNA-23a/PTEN/PI3K/Akt/mTOR/SNAIL途徑可為肝纖維化的逆轉提供治療靶點。

2.1.3 基因間長鏈非編RNA-p21(lincRNA-p21) lincRNA-p21最早是在小鼠成纖維細胞內被鑒別出來的[31]，其定位在Cdkn1a(p21)基因上游約15 kb 處，屬17號染色體，長度約為3 kb。Zheng等[18]研究發現，上調lincRNA-p21的表達水平能夠抑制體外HSC活化和減輕CCl4誘導小鼠的肝纖維化程度。而該過程的分子機制，可能為lincRNA-p21充當ceRNA直接競爭性結合miRNA-181b，使miRNA-181b表達減弱，編碼磷酸酯酶的基因PTEN表達增加，從而使PI3K/Akt 信號通路的激活受抑制，HSC的活化受抑制[32]。提示lincRNA-p21為HSC的活化抑制因子，有望成為逆轉肝纖維化的分子靶點。

2.2 具有促肝纖維化作用的lncRNA

MALAT1、lncRNA-ATB、PVT1、HOTAIR、lncRNA-H19和SNHG7皆具有促肝纖維化作用。而這些lncRNA亦具有相似的特性，如它們都可以充當ceRNA與相關的miRNA結合，調控下游的信號轉導途徑，促進HSC的增殖活化，促進肝纖維化。因此，下調它們在肝纖維化患者體內的表達水平，可能是阻止肝纖維化進一步發展的良好舉措。

2.2.1 肺腺癌相關轉錄因子1(MALAT1) MALAT1是一種核內保守的基因間lncRNA，于細胞核中富集，位于人染色體11q13區域，其轉錄本長度約為8000 nt。Yu等[19]研究證明，MALAT1可作為ceRNA與miR-101b競爭性結合，上調miRNA-101b靶標RAC1的蛋白表達水平，促進HSC活化。Wu等[33]研究發現，MALAT1可與組蛋白去乙酰化酶(SIRT1)結合，抑制SIRT1的表達，從而促進LX-2人HSC活化以及肌成纖維細胞標志物α-SMA和COL1α1的合成，促進肝纖維化。因此，靶向MALAT1/miRNA-101b/RAC1途徑和調控SIRT1過度表達可能會成為治療肝纖維化的新方案。

2.2.2 TGFβ激活的lncRNA(lncRNA-ATB) lncRNA-ATB是TGFβ信號通路的關鍵調節因子，由TGFβ活化，定位于人第14號染色體，長度約為80 kb。據報道[20]，lncRNA-ATB可作為ceRNA競爭性結合miRNA-425-5p，促進HSC的激活以及增加膠原的合成量，進而加劇肝纖維化。此外，lncRNA-ATB還可通過與miRNA-200a競爭性結合，降低其表達，同時增加β-catenin的表達，從而促進HSC的活化和增加Ⅰ型膠原的合成，加劇肝纖維化[34]。因此，將lncRNA-ATB視為一個新的促肝纖維化因子，并對其進行敲低甚至敲除，以減少HSC的活化數量和抑制膠原蛋白的合成，不失為一個臨床治療肝纖維化的良好方案。

2.2.3 漿細胞瘤變型異位因子1(PVT1) PVT1的轉錄本長度約為1957 nt，是一種基因間lncRNA，由定位染色體8q24區上的PVT1基因編碼。PVT1是一個十分重要的癌癥lncRNA,其致癌作用已在多種癌組織中被證實，如肝細胞癌[35]、膽囊癌[36]和卵巢癌[37]。Zheng等[21]研究表明，操控PVT1基因沉默可在一定程度上抑制HSC的活化，其可能是由于PVT1基因的沉默使EMT過程受阻所致。而沉默PVT1基因，還會使Hh信號通路負向調節因子Patched1(PTCH1)的表達增強[38]，使Hh信號通路失活， HSC的增殖受抑制[21]。此外，PVT1可作為ceRNA與miRNA-152結合，減弱miRNA-152對小干擾PVT1的抑制，增強小干擾PVT1對Hh信號通路負調控因子PTCH1的脫甲基誘導，并表觀遺傳地下調PTCH1的表達水平，激活肝纖維化中的Hh信號傳導通路，促進HSC的激活和EMT過程，加劇肝纖維化[21]。

2.2.4 同源盒轉錄反義RNA(HOTAIR) HOTAIR是由HOXC基因片段轉錄而來的反義基因間lncRNA，定位于人12號染色體q13.13，轉錄本長度約為2158 bp，具有致癌作用[39-40]。Bian等[22]研究表明，上調HSC中HOTAIR的表達水平，可在一定程度上沉默MEG3，促進HSC增殖活化，促進肝纖維化；而沉默HOTAIR則作用相反。探究其分子機制，一方面可能為HOTAIR增加組蛋白修飾酶復合物PRC2在MEG3啟動子區域中的占有率，增強PRC2對組蛋白H3K27的三甲基化誘導，從而使MEG3低表達，促使HSC活化[22]。另一方面可能為HOTAIR充當ceRNA與miRNA-148b競爭性結合，削弱miRNA-148b對其靶標DNA甲基轉移酶1(DNA methyltransferase 1,DNMT1)表達的抑制作用，促進DNMT1的表達，從而增強HSC中DNMT1對MEG3、p53表達的抑制作用，促進HSC活化，增進肝纖維化進程[16]。提示HOTAIR參與了MEG3的表觀遺傳調控，有望作為治療肝纖維化的潛在靶點。

2.2.5 長鏈非編碼RNA-H19(lncRNA-H19) lncRNA-H19來源于人染色體11P15.5區域上的H19印跡基因，轉錄本長度約為2.3 kb，可調節DNA甲基化、染色質重構，也可作為miRNA前體對細胞內的組蛋白進行修飾，繼而多水平調控機體的功能。最近，有研究[23]顯示， lncRNA-H19可通過充當ceRNA直接競爭性結合miRNA-148a，釋放miRNA-148a的靶標泛素特異性蛋白酶4，使轉化生長因子βⅠ型受體(transforming growth factor-β receptor typeⅠ,TGFβRⅠ)泛素化水平上調，促進TGFβRI與 TGFβ1結合，進而激活HSC并促進肝細胞EMT的發生，促進肝纖維化。此外，在膽道閉鎖患者的纖維化肝組織中，lncRNA-H19的表達水平會隨著肝纖維化程度的加深而升高[41-42]。并且，lncRNA-H19可通過控制鞘氨醇1-磷酸受體2/鞘氨醇激酶2以及miRNA let-7/高遷移率蛋白A2途徑影響膽道閉鎖患者的膽管細胞增殖和肝損傷[41-42]。因此，lncRNA-H19有望成為肝纖維化的治療靶標和診斷標志物。

2.2.6 小核RNA宿主基因7(SNHG7) SNHG7是一種新發現的lncRNA，長度約為2157 nt，定位于9號染色體。據報道，SNHG7是一種典型的致癌基因，能促進多種癌細胞的增殖、侵襲和遷移，如肺癌[43]、膀胱癌[44]和前列腺癌[45]等。Yu等[24]通過體內和體外實驗證明， SNHG7可充當ceRNA競爭性結合miRNA-378a-3p，減弱其對其靶標紊亂片段極性蛋白2的抑制作用，加快Wnt信號通路的激活速度，并促進HSC活化和肝纖維化。提示lncRNA-SNHG7可作為一種生物標志物來診斷和判斷肝纖維化預后。

3 總結與展望

伴隨著高通量測序技術的出現和進步，大量的lncRNA被不斷地鑒定出來。雖然lncRNA無法編碼蛋白質，但其可在轉錄前、轉錄及轉錄后等層面參與調控細胞的活性和基因的表達，從而于各方面不同程度地參與肝纖維化、肝癌等疾病的發生發展。近年來，通過研究lncRNA在調控肝纖維化的信號通路上的異常表達，發現眾多的lncRNA可通過充當ceRNA與 mRNA競爭性結合，直接調控mRNA靶基因等因子來調節HSC的活化程度和衰老速度，進而調控肝纖維化的發展進程。不難發現，這是一張巨大且相互交錯的基因網，為肝纖維化的病理進程研究提供了廣闊的可探索空間。雖然到目前為止，學者們對lncRNA生物功能及分子機制的研究，特別是其在肝纖維化等疾病發病機制上的研究尚不完全。相信隨著科研技術的不斷進步，將會逐漸發現lncRNA在肝纖維化中更多的調控機制和功能，為肝纖維化的程度鑒別，臨床治療及預后判斷等提供更新更堅實的理論基礎。

作者貢獻聲明：盧能源負責文獻檢索，文章思路設計，論文撰寫與修訂；鐘芳菲、鄧青梅、楊妍琪負責文獻檢索與資料分析；鄭洋、趙鐵建、梁天堅負責指導撰寫文章及最后定稿。