microRNA-34a在上皮-間充質轉化中的作用

李占峰，肖 楠，姚建新，姚紫陽，姚志峰

microRNAs(miRNAs)是一類高度保守的單鏈非編碼RNA，長度只有20～24個核苷酸。它們可以與mRNAs的3＇非翻譯區域(untranslated regions, UTR)結合，抑制信使RNA(mRNA)翻譯，或誘導mRNA降解或脫腺苷化，從而在轉錄后沉默基因表達[1]。miRNAs通過調控靶基因表達，參與多種信號傳導途徑，調控包括細胞增殖、轉移、凋亡、衰老、分化、自噬和免疫反應等諸多生物學過程[2]，并與腫瘤等疾病的發生、發展密切相關[3]。miRNAs可能發揮腫瘤抑制因子或癌基因作用[4]。miRNA 34a(miR-34a)作為miR-34家族成員[5]，是首個被證實受p53直接調控的miRNA[6]。miR-34a在大腸癌、前列腺癌、乳腺癌、肺癌、肝癌和骨肉瘤等組織中均有異常表達。許多研究表明，miR-34a作為一種生物學標志物，可用于腫瘤的診斷和預后判斷[7-8]。原發腫瘤細胞可通過上皮-間充質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)獲得遷移和侵襲能力，導致腫瘤轉移[9-10]。miR-34a可通過EMT而影響腫瘤轉移。近年來研究表明，mRNA、環狀RNA(circRNA)、偽基因轉錄本和長鏈非編碼RNA(LncRNA)等通過microRNA反應元件調節相互表達，從而競爭性結合miRNAs，即競爭性內源RNA(ceRNA)機制[11]。本文就miR-34a在腫瘤中的作用及其相關EMT機制，尤其是ceRNA機制在調節miR-34a及EMT中的作用做一綜述。

1 miR-34a調控腫瘤細胞EMT導致腫瘤轉移

大多數腫瘤細胞通過EMT獲得轉移和侵襲能力，導致腫瘤轉移[12]。通過EMT過程，上皮細胞失去了形態和黏附能力，并獲得了間質表型[13]。EMT的特點是使細胞失去極性，一些上皮標志物如鈣黏附蛋白E、細胞角蛋白和α-連環蛋白表達減少，而一些間質標志物如神經型鈣黏附蛋白、波形蛋白、纖維連接蛋白和基質金屬蛋白酶表達增加[9,12-13]。

EMT產生具有侵襲性的細胞，使它們能進入血液，并經全身轉移到其他器官。EMT是腫瘤進化過程中的重要過程，為腫瘤細胞提供適合生存的微環境。適當的細胞環境、細胞因子和細胞外信號可誘導EMT[14]。miR-34a對腫瘤細胞的增殖、轉移和侵襲有負性調控作用[15-16]。研究表明，使用多西環素誘導pri-miR-34a表達可致人結腸癌細胞SW480中波形蛋白下調和E-cadherin上調，提示miR-34a可負性調節EMT以抑制癌細胞增殖和侵襲[17]。

2 miR-34a調控EMT的作用機制

2.1miR-34a與EMT誘導轉錄因子(EMT-transcription factors, EMT-TFs)的3′-UTR結合調控EMT 一項使用多西環素誘導pri-miR-34a表達的研究發現，除EMT標記的表達變化外，還觀察到EMT-TFs的變化，提示其對腫瘤相關EMT的激活是必不可少的[18]。miRNAs可與EMT-TFs結合，從而形成雙負反饋環來干擾腫瘤相關的EMT[19]。與miR-34a相關的EMT-TFs有如下3種：①鋅指轉錄因子SNAIL家族，包括SNAIL1、SNAIL2和SNAIL3；②ZEB轉錄因子，包括ZEB1和ZEB2；③基本螺旋-環狀-螺旋轉錄因子家族，包括TWIST1、TWIST2和E12/E47[20-21]。miR-34a直接與EMT-TFs的3′-UTR結合，調節腫瘤相關的EMT。SNAIL 3′-UTR含有與miR-34匹配的保守序列[17,22]。SNAIL家族是唯一與所有3個miR-34家族成員(miR-34a/b/c)具有匹配序列的EMT-TFs，進一步研究證實SNAIL是miR-34家族的直接靶標[22]。除了SNAIL家族外，其他EMT-TFs(如ZEB1、ZEB2和TWIST1)的3′-UTR也存在與miR-34a匹配的保守序列以及干性因子BMI1、CD44、CD133和c-MYC，這些干性因子通過與miR-34a直接結合而表達降低[5]。

2.2miR-34a通過p53調控EMT p53失活或突變是因抑制SNAIL1的表達和活性，進而促進腫瘤細胞發生EMT[22]。p53激活則通過誘導miR-34a/b/c下調SNAIL表達，抑制miR-34a/b/c則致SNAIL上調，細胞呈EMT標記的改變和相關特征，從而增強細胞遷移和侵襲能力。miR-34a異位表達誘導EMT，下調SNAIL表達[17]。故p53、SNAIL1和miR-34形成反饋回路以控制腫瘤細胞產生EMT[22]。

2.3miR-34a通過靶向TP53和MDM4誘導p53激活 除了p53調節miR-34a的表達外，miR-34a還通過直接靶向TP53和MDM4來誘導p53激活。TP53和MDM4是p53反式激活抑制劑[23]。miR-34a通過靶向多種p53抑制劑來激活p53的功能，從而從表觀遺傳學角度提高p53的轉錄活性[24]。miR-34a對p53網絡的正負效應的復雜性表明，miR-34a不是簡單地促進p53反應，而是可能促進p53對遺傳毒性應激反應的穩定性[23]。與p53野生型細胞相比，p53突變的卵巢癌細胞miR-34a表達下調[25]。當細胞用p53化學激活劑Nutlin-3a處理時，miR-34a的表達顯著增加[26]。這表明miR-34a是p53的下游靶點。更重要的是，p53通過增強miR-34a的表達來調節SNAIL的表達和活性，從而減少EMT[22]?？傊琺iR-34a、p53和EMT形成了一個復雜的網絡，以影響彼此的功能[16]。

2.4miR-34a經Wnt、TGF-β1/Smad3/4、Notch信號傳導途徑調控EMT miR-34a不僅可經調控EMT-TFs和抑癌基因p53，還可經Wnt[27]、TGF-β1/Smad3和Notch1等信號傳導途徑調控EMT[28]。

2.4.1Wnt信號傳導通路：研究表明，miR-34a可通過調節正常乳腺和乳腺癌細胞中的多途徑相關基因負性調控Wnt的轉錄活性[29]。淋巴增強因子1(LEF1)是Wnt信號傳導通路中的重要轉錄因子，參與細胞增殖和侵襲的調控。miR-34a經調節LEF1表達來調控前列腺癌細胞EMT，并與前列腺癌細胞遷移和侵襲呈負相關。同樣，miR-34a可能經特異性抑制LEF1調控前列腺癌的EMT過程[30]。miR-34a經抑制膀胱癌TCF1/LEF1軸而促進人膀胱癌阿霉素耐藥株的化療敏感性[31]。HOX轉錄反義RNA(HOX transcript antiense RNA，HOTAIR)是一種高度豐富和保守的反義RNA，參與包括胃癌對順鉑的耐藥性在內的許多重要生物學過程，敲除HOTAIR經上調miR-34a抑制順鉑耐藥，提示HOTAIR/miR-34a軸對胃癌細胞的作用涉及PI3K/Akt和Wnt/β-catenin信號傳導通路[32]。

2.4.2Notch信號傳導通路：除了EMT-TFs外，miR-34a還可以通過與關鍵靶基因結合來調節EMT。例如，miR-34a可以與結腸癌細胞和宮頸癌細胞中Notch1和Jagged1的3＇-UTR結合，從而抑制細胞遷移能力，并抑制波形蛋白和纖維連接蛋白的表達，促進E-cadherin的表達[28]。miR-34a通過調節與耐藥性相關的靶基因JAG1和Notch1來減弱對紫杉醇的耐藥性。NFIX環狀RNA通過Notch信號傳導通路特異性結合miR-34a-5p來調控Notch1的表達，進而促進膠質瘤的進展[33]。

2.4.3轉化生長因子-β1(TGF-β1)及其他信號傳導通路：TGF-β1是一種影響同一細胞自分泌或鄰近細胞旁分泌的分泌蛋白，具有促瘤或抑瘤作用。有研究證實miR-34a可通過抑制鼻咽癌細胞Smad4的表達，逆轉轉化生長因子-β誘導的鼻咽癌細胞的侵襲和遷移[34]。白細胞介素-6受體(IL-6R)作為miR-34家族成員的靶點，可介導信號傳導和轉錄激活因子3(STAT3)的激活，而STAT3則通過保守的結合位點與miR-34a結合，抑制miR-34a的表達，而這種抑制作用是白細胞介素-6誘導的EMT和侵襲所必需的[35]。因此，IL-6R/STAT3/miR-34a構成了調控EMT以抑制腫瘤進展的反饋環。

3 ceRNA-miR-34a調控的新機制

ceRNA假說最初于2007年由Ebert等人提出，該假說認為mRNA、circRNA、偽基因轉錄本和LncRNA通過microRNA響應元件(microRNA responsive element，MRE)調控相互之間的表達，以競爭性結合miRNAs，目前已有大量研究支持該假說[11,36]。

LncRNA是指長度超過200個核苷酸的RNA，本身不編碼蛋白質，與包括腫瘤在內的多種疾病有關。研究發現，Lnc015192及其靶基因Adam12通過ceRNA機制特異性結合miR-34a，促進乳腺癌轉移。敲除miR-34a后，Adam12和Lnc015192顯著上調，而敲低Adam12和Lnc015192則抑制乳腺癌細胞的遷移、侵襲和EMT。進一步的實驗表明，Lnc015192通過作為miR-34a的ceRNA調控靶基因Adam12的表達[37]。SNHG7是另一種通過調節miR-34a促進腫瘤生長和EMT的LncRNA[38]。進一步研究發現SNHG7作為ceRNA，通過結合miR-34a增加大腸癌GALNT7的表達，即通過與內源性miR-34a競爭，調控PI3K/Akt/mTOR通路，促進細胞增殖和轉移從而發揮致癌作用[39]。LncOC1通過結合miR-34a和另一miR-34c，促進卵巢癌細胞的增殖和遷移[40]。

circRNA是最近發現的另一種新型RNA，不同于眾所周知的線性RNA，它形成一個共價閉合的連續環。通常circRNA分子中的3′和5′端連接在一起。內源性circRNA對核酸外切酶介導的降解具有抗性，鑒于其5′或3′端的缺失，可能比細胞中的大多數線性RNA更穩定[41]。circRNA在細胞質中富集，并與其線性mRNA廣泛互補，顯示了這些RNA可能通過結合microRNA發揮其功能。因此，circRNA在基因調控中具有潛在的重要作用[41]。研究發現，circRNA可以調節EMT，這表明一些circRNA可能影響EMT相關的細胞功能，包括癌變和轉移[42]。最近研究表明，circRNA在腫瘤中起到miR-34a分子海綿的作用。circGFRA1和GFRA1在三陰性乳腺癌(triple negative breast cancer，TNBC)中可能通過調節miR-34a發揮作用[43]。miR-34a也被證明可直接抑制大腸癌和乳腺癌中的乳酸脫氫酶A(LDHA)的表達[44]，以及肺癌和急性髓細胞白血病中重要的免疫檢查點抑制劑PDL1的表達[45]。進一步研究表明，PDL1和LDHA均是通過調節miR-34a來促進TNBC細胞增殖和轉移的ceRNA[46]。因此，同時針對PDL1和LDHA的靶向治療，可能為乳腺癌特別是TNBC開辟一條新的治療途徑。另一種circRNA circNFIX通過Notch信號傳導通路競爭性結合miR-34a-5p，以調節Notch1，最終促進膠質瘤的進展[33]。與正常腦組織相比，circNFIX在膠質瘤中過度表達，Notch信號傳導通路在腫瘤組織中的表達明顯上調。Si-circNFIX和miR-34a可促進細胞凋亡，而miR-34a抑制劑可抵消Si-circNFIX對膠質瘤細胞的抑制作用。體內實驗進一步表明，Si-circNFIX通過調節miR-34a和Notch信號傳導抑制膠質瘤細胞的生長[33]?？傊?，ceRNA通過特異性吸附miR-34a來調控基因表達，并在腫瘤發生、發展和EMT中發揮重要作用。

4 問題與展望

miR-34a作為腫瘤相關EMT的重要負性調節因子，在抑制腫瘤發生及轉移方面發揮著相當重要的作用。miR-34a是一種很有前途的腫瘤抑制因子，而關于miR-34a的臨床前期研究證實了其腫瘤抑制作用機制。隨著miR-34a療法的逐步應用，也出現了一些問題。首先，miRNA降解會阻止miR-34a穿透毛細血管內皮進入靶細胞。其次，miR-34a的免疫反應也值得重視。一項名為NCT02862145的臨床試驗由于發生了5次miR-34a免疫相關不良事件而被終止。如果miR-34療法使用納米載體，那么納米粒子的毒性也值得商榷。再者，miR-34a治療效果不佳的原因可能與EMT或腫瘤基因信號傳導過程中，抑制腫瘤細胞miR-34a再表達有關，而miR-34a在正常細胞中的異常表達則可能是產生系統性不良反應的基礎。ceRNA的作用機制涉及mRNA、circRNA、偽基因轉錄本和LncRNA表達的相互調節，在EMT過程中競爭性結合microRNA。因此，miR-34a和EMT之間的通路網絡可能作為重要的生物學標志物或是精準治療靶點，為惡性腫瘤診斷與治療開辟了新的道路。