液相色譜-串聯質譜法檢測食品中 羅丹明B的殘留量

白旭東 孫曉娟 谷巖

【摘要】 目的：建立食品中羅丹明B的液相色譜-電噴霧質譜檢測方法（UPLC-ESI-MS/MS）。方法：樣品經酸化乙腈提取，正己烷去脂后，經固相萃取小柱（MCX）凈化，富集后采用液相色譜-電噴霧質譜進行檢測，以正離子多反應監測模式測定，外標定量。結果：羅丹明的線性范圍為2-50 ng/mL，加標回收率為90.0%～110.0%，相對標準偏差小于10.0%（n=6）;方法檢出限為1 ?g/kg。結論：該方法快速、準確、靈敏，適合用于食品中羅丹明B的確證檢測。

【關鍵詞】 羅丹明B;液相色譜串聯質譜儀;固相萃取;食品;殘留量

【DOI編碼】 10.3969/j.issn.1674-4977.2020.05.022

Determination of Rhodamine B Residues in Feed by Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

BAI Xu-dong，SUN Xiao-juan，GU Yan

（Liaoning Inspection，Examination & Certification Centre，Shenyang 110036，China）

Abstract： Objective To establish an analytical method for the detection of rhodamine B residues in feed. Methods After the samples were extracted by acidified acetonitrile，it was purified by solid phase extraction cartridge（MCX）after removal of fat，after enrichment，it was detected by a high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry（LC-MS/MS）. The positive electrospray ionization（ESI+）mode and multiple reactions monitoring（MRM）were adopted to detect，external standard method was used for quantitative determination. Results The linear range of rhodamine B was 2.0-50 ng/mL. The average recoveries of rhodamine B from spiked sample at three concentration levels were between 90% and110% with RSD（n=6），the relative standard deviations（RSDs）were less than 10%（n=6）. The limits of quantitation（LOD）were 1 ?g/kg. Conclusion The proposed method is fast，accurate and sensitive，which is suitable for detecting rhodamine B in feed samples.

Key words： Rhodamine B;liquid chromatography tandem mass spectrometer;solid phase extraction;food;residues

羅丹明B（rhodamine B，RhB），又稱玫瑰紅B，俗稱花粉紅[1]。羅丹明B是以氧雜蒽為母體的堿性咕噸染料，具有特殊的結構及熒光特性，是常用的熒光分析試劑，是用于腈綸、造紙、油漆、鋼鐵、礦業等領域的工業染料，羅丹明B具有潛在的致癌、致畸和致突變作用[2-3]，日本及歐美等國家和地區均已禁止用于食品加工中，中國衛生部也將其列在《食品中可能違法添加的非食用物質和易濫用的食品添加劑品種名單（第一批）》中，禁止在食品中使用。由于羅丹明B價格低廉、色彩絢麗、穩定性強，仍有部分不法商販為了牟取暴利，違法將其加入到辣椒油、辣椒醬等調味品中，因此，建立食品中羅丹明B的檢測方法，有助于控制工業染料在食品中的濫用，應對突發的食品安全事件。

羅丹明B目前的主要檢測方式是高效液相色譜法[4-6]、液相色譜-質譜聯用法[7-10]、熒光探針法[11]、免疫檢測法[12]等，主要樣品的前處理方式是液-液萃取法[7]、固相萃取法[9]、微波輔助萃取法[13]、QuEChERS[14]以及凝膠滲透色譜凈化法[8，15]。

本文采用酸化乙腈提取樣品，經固相萃取柱進行凈化，采用液相色譜-質譜聯用法進行檢測，方法靈敏度高，準確度高，適合于多種食品中羅丹明B的檢測。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

TQD型三重四級桿質譜儀（沃特斯公司，配有電噴霧離子源）;氮吹儀（屹堯公司）;離心機（美國日立公司）。

羅丹明B（購于德國DR.公司）。

乙腈、甲醇、正己烷和冰醋酸（色譜純，Fisher公司）;乙酸銨（分析純，國藥集團）;MCX固相萃取柱（6 mL，150 mg，Waters公司）;實驗室用水為Milli-Q超純水。

樣品為市售。

1.2 試驗方法

1.2.1 標準儲備液的配制

標準儲備溶液配制：精密稱取羅丹明B適量，用甲醇溶解，分別將待測物質配制成0.5 mg/mL的儲備溶液。

1.2.2 樣品制備

將樣品混勻，精密稱取2.00 g于50 mL離心管中，加入10 mL2%的酸化乙腈，渦旋2 min，超聲10 min，水平震蕩10 min（速度200 Moti/min），在-10 ℃下10000 rpm離心8 min;轉移上清液于另一離心管中，加入5 mL乙腈飽和的正己烷，渦旋2 min，在5000 rpm離心5 min，棄去正己烷層（重復3遍），乙腈層于氮氣流下吹至近干， 加入5 mL2%甲酸溶液，渦旋混合30 s，在-10 ℃下4300 rpm離心5 min，上清液經MCX 6cc 150 mg固相萃取柱（6 mL5%甲醇氨，6 mL甲醇，6 mL水，6 mL2%甲酸溶液依次活化）純化，先后用5 mL甲醇和5 ml5%甲醇淋洗，抽干，6 mL5%甲醇氨洗脫，洗脫液在65 ℃水浴中用氮氣吹干，加入5 mL10%乙腈溶解殘渣，用0.22 m的濾膜，過濾，作為樣品溶液。

1.2.3 儀器條件

1）色譜條件

色譜柱：a）色譜柱：waters C18柱，100×2.1 mm，粒徑1.7 ?m;b）流速：0.3 mL/min;c）柱溫：35 ℃;d）進樣量：5 μL;e）流動相：A為0.1%甲酸水溶液，B為0.1%甲酸乙腈溶液，洗脫梯度：0～2.0 min，90%～40% A;2.0～4.0 min，40% A;4.0～4.5min，40%～90% A;4.5～7 min，90% A。

2）質譜條件

質譜條件：a）電離方式：電噴霧正離子模式;b）檢測方式：多反應檢測（MRM）;c）霧化氣壓力：30 psi;d）離子噴霧電壓：3500 V;e）干燥氣溫度：330 ℃;f）干燥氣流速：11 L/min;g）*：定量離子。

2 結果與分析

2.1 儀器條件優化

首先將0.5 ?g/mL的待測化合物的標準溶液分別以流動注射的方式在正離子模式下進行母離子全掃描，確定分子離子，然后對其子離子進行全掃描，優化碰撞能量等參數得到羅丹明B的最佳質譜條件，羅丹明B檢測參數見表1。

2.2 樣品提取和凈化方式的選擇

2.2.1 樣品提取溶液的種類和體積選擇

羅丹明B為堿性物質，易溶于水。研究了酸化甲醇-水、酸化乙腈-水體系的萃取效率，對含油脂較少的樣品，發現有機溶劑比例增加時，回收率沒有明顯的變化，當樣品中油脂含量較高時，加入有機溶劑回收率明顯提高，隨著有機溶劑比例的增加，色素等物質在萃取液中明顯減少，沉淀蛋白作用也很顯著，當提取溶劑2%酸化乙腈時，提取溶劑只需要10 mL，調味油、炒貨和臘腸樣品的提取回收率最高，離心后，可以去除大部分的油脂和蛋白，同時，對于色素含量較高的辣椒面、辣椒醬等樣品，隨著乙腈的比例增加，色素的提取率降低，干擾較少，因此文本選擇了2%酸化乙腈，體積為10 mL作為提取溶劑。

2.2.2 除去脂肪、油脂的方法的選擇

對于調味油、臘腸和炒貨的樣品，油脂、脂肪含量較高，酸化乙腈也會提取出一部分，為了更好的延長色譜柱的使用壽命，保護好儀器，進一步去除油脂十分必要，本文考察了乙腈飽和的正己烷和石油醚去除油脂的效率，實驗結果表明，加入5 mL乙腈飽和的正己烷，重復提取2遍后，第3遍正己烷層已經變為無色，因此本方法采用5 mL乙腈飽和的正己烷萃取3遍來去除油脂和脂肪。

2.2.3 固相萃取柱的選擇

本文分別考察了HLB、MAX、C18和MCX的固相萃取小柱，提取回收率四種類型的柱子結果相差不大，但是采用MCX小柱凈化后的樣品，基質效應較小，因此，本文選擇了MCX小柱進行樣品凈化。

2.2.4 樣品基質效應的消除

大氣壓噴霧電離離子源（ESI）容易受樣品基質的影響。基質是樣品中被測物以外的組分，常對被測物分析有顯著的干擾，并影響測定結果的準確性，這些干擾和影響被稱為基質效應。基質效應表現為離子抑制或離子增強。本文所涉及的樣品較為復雜，特別是調味油、臘腸和炒貨等樣品，基質較為復雜，隨著最終的定容體積的增加，基質效應不斷降低，由于羅丹明B在質譜上靈敏度較高，因此，最終選擇定容體積為5 mL，來消除基質效應，必要時，復雜基質可以采用基質空白配制標準曲線，進一步消除基質效應。

2.3 方法的線性范圍及檢出限

用10%乙腈將羅丹明B配制成濃度為2、4、10、20和50 ng/mL的系列標準溶液。按照“1.2.3 儀器條件”進行檢測，以待測物濃度為橫坐標，待測物峰面積峰面積為縱坐標繪制標準曲線。結果表明羅丹明B在2～50 ng/mL范圍內線性關系良好，可滿足樣品的定量分析的需要。檢出限和定量限的配制采用基質空白溶液，檢出限（以3倍信噪比（S/N=3）計）及定量限（以10倍信噪比（S/N=10）計）見表2。

2.4 回收率及精密度實驗

以空白基質為樣品，在5、10和50 ?g/kg三個水平下進行加標回收實驗，平行測定6個樣品，計算加標回收率。結果見表3。

2.5 實際樣品測定

應用本法測定了10批調味油，10批火鍋底料，10批炒貨，5批臘腸，均未檢出羅丹明B。

3 結論

本文所建立的方法快速、準確、簡單，可對多類食品中的羅丹明B準確定量，經方法學驗證，能夠滿足檢測技術要求，可以為檢驗人員提供檢測依據，同時可為監管進行服務。

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【作者簡介】

白旭東（1973-），男，副主任中藥師，學士，研究方向為食品，藥品和醫療器械的檢驗與審評。

孫曉娟（1986-），女，學士，研究方向為保健食品檢驗。

通訊作者：谷巖（1975-），女，碩士，研究方向為食品檢驗與食品安全，E-mail：591131710@qq.com。