茶樹CsCIPK12與CsKIN10的互作鑒定及其表達(dá)分析

馮霞，邸太妹，彭靖，李娜娜，姚利娜，楊亞軍，王新超，王璐

茶樹CsCIPK12與CsKIN10的互作鑒定及其表達(dá)分析

馮霞，邸太妹，彭靖，李娜娜，姚利娜，楊亞軍，王新超*，王璐*

中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所/國(guó)家茶樹改良中心/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部茶樹生物學(xué)與資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310008

蔗糖非酵解-1相關(guān)蛋白激酶（Sucrose non-fermenting 1-related protein kinase，SnRK）在代謝調(diào)控和脅迫信號(hào)傳遞中發(fā)揮重要的作用。本文以茶樹SnRK3亞家族的基因和SnRK1亞家族的基因?yàn)檠芯繉?duì)象，通過序列比對(duì)和進(jìn)化分析，發(fā)現(xiàn)CsCIPK12和CsKIN10都具有N端激酶結(jié)構(gòu)域和C端調(diào)節(jié)域；CsCIPK12具有與CBLs結(jié)合的NAF/FISL結(jié)構(gòu)域，與擬南芥AtCIPK12，楊樹PtCIPK17、18、19同源關(guān)系最近；而CsKIN10具有泛素相關(guān)的UBA結(jié)構(gòu)域，與楊樹PtSnRK1同源關(guān)系最近。通過酵母雙雜交系統(tǒng)，證實(shí)了CsCIPK12和CsKIN10蛋白存在相互作用。表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，在自然冷馴化過程中，的表達(dá)模式與前期對(duì)的研究結(jié)果一致，在龍井43、浙農(nóng)12、大面白3個(gè)茶樹品種中受低溫不同程度地誘導(dǎo)；4℃短時(shí)低溫處理發(fā)現(xiàn)，和在成熟葉中受低溫顯著誘導(dǎo)（最高誘導(dǎo)水平分別為4倍和2.3倍），而在新梢中，二者對(duì)低溫的響應(yīng)并不顯著；ABA、葡萄糖以及蔗糖處理發(fā)現(xiàn)，和在成熟葉中受這3種處理的顯著誘導(dǎo)。結(jié)果表明，CsCIPK12與CsKIN10蛋白相互作用，參與ABA和糖信號(hào)途徑，在茶樹低溫脅迫響應(yīng)中可能發(fā)揮重要作用。

茶樹；CIPK12/SnRK3.9；KIN10/SnRK1.1；低溫脅迫；酵母雙雜交

蔗糖非酵解-1相關(guān)蛋白激酶（Sucrose non-fermenting 1-related protein kinase，SnRK）在代謝調(diào)控和脅迫信號(hào)傳遞中發(fā)揮重要作用。SnRK是一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，亞家族為SnRK1，SnRK2和SnRK3。其中，SnRK3是植物特有的一類蛋白激酶，由于其與鈣調(diào)磷酸酶B類似蛋白CBL（Calcineurin B-like）結(jié)合，也被稱為CIPK（CBL-interacting kinase）蛋白激酶[1]。作為鈣離子信號(hào)受體蛋白的CBL通過結(jié)合SnRK3/CIPK蛋白的NAF/FISL結(jié)構(gòu)域并激活SnRK3/CIPK，進(jìn)而磷酸化下游靶蛋白，傳遞鈣信號(hào)[2]。CIPK主要參與調(diào)控植物的非生物脅迫響應(yīng)，其最先在擬南芥的鹽過度敏感（Salt overly sensitive，SOS）通路中被發(fā)現(xiàn)。鹽脅迫下，鈣離子與AtSOS3/CBL4結(jié)合，使AtCBL4與AtSOS2/CIPK24形成復(fù)合體，通過調(diào)節(jié)質(zhì)膜Na+/H+反向轉(zhuǎn)運(yùn)體AtSOS1，增強(qiáng)植物的耐鹽性[3-4]，隨后SOS2/CIPK24調(diào)節(jié)耐鹽性的作用在楊樹中也得到證實(shí)[5]。其次，研究發(fā)現(xiàn)AtCBL9-AtCIPK3可以調(diào)控ABA響應(yīng)信號(hào)途徑，的缺失改變了ABA、低溫和鹽脅迫響應(yīng)基因的表達(dá)[6-7]，表明了CIPK在植物應(yīng)對(duì)低溫等非生物脅迫中的重要作用。Yan等[8]發(fā)現(xiàn)，能夠響應(yīng)低溫、ABA、高鹽、干旱等非生物脅迫，同時(shí)AtCIPK14蛋白可與AtCBL2/3/9以及AtSnRK1.1和AtSnRK1.2互作，參與葡萄糖信號(hào)途徑。蘋果中MdCIPK22與bZIP家族轉(zhuǎn)錄因子MdAREB2互作，并且磷酸化MdAREB2蛋白，以此調(diào)控ABA響應(yīng)信號(hào)途徑[9]。此外，MdCIPK13與MdCBL3互作，磷酸化蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白MdSUT2.2，通過調(diào)控糖代謝途徑來增強(qiáng)蘋果的耐鹽性[10]。總之，CIPK與鈣離子感受器CBL結(jié)合，磷酸化下游靶標(biāo)，參與ABA和糖等信號(hào)途徑，調(diào)控植物的非生物脅迫響應(yīng)。

SnRK1蛋白激酶參與調(diào)控細(xì)胞對(duì)能量脅迫的反應(yīng)，調(diào)節(jié)植物的生長(zhǎng)發(fā)育，在植物抗逆生理上也發(fā)揮重要作用。Jossier等[11]通過對(duì)過表達(dá)植株的生理生化分析，發(fā)現(xiàn)在糖信號(hào)及ABA信號(hào)通路中發(fā)揮功能，轉(zhuǎn)基因株系中淀粉和可溶性糖的濃度發(fā)生改變。Lee等[12]發(fā)現(xiàn)水稻OsSnRK1A受OsCIPK15調(diào)節(jié)，將缺氧脅迫信號(hào)與糖感應(yīng)信號(hào)級(jí)聯(lián)，調(diào)節(jié)糖和能量的產(chǎn)生，使水稻抵御淹水脅迫。最近的研究發(fā)現(xiàn)ShSnRK1能夠與冷誘導(dǎo)蛋白ShCIGT相互作用，降低轉(zhuǎn)基因番茄對(duì)ABA的敏感性，增強(qiáng)番茄的耐寒性和抗旱性[13]。

茶樹是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)作物之一，喜溫畏寒，極易遭受低溫脅迫危害，我國(guó)主要產(chǎn)茶地區(qū)多發(fā)“倒春寒”現(xiàn)象，嚴(yán)重影響茶葉的產(chǎn)量和品質(zhì)。因此，解析茶樹抗寒分子機(jī)制成為茶學(xué)研究的熱點(diǎn)之一。Ca2+、ABA和糖等作為信號(hào)分子，均參與低溫信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而激發(fā)植物的抗寒響應(yīng)[14, 15]。SnRK家族激酶參與Ca2+、ABA和糖信號(hào)途徑，在調(diào)控低溫等非生物脅迫中發(fā)揮重要作用。茶樹中關(guān)于SnRK3/CIPK和SnRK1在逆境方面的報(bào)道較少，Liu等[16]在茶樹中鑒定出18個(gè)s，分析了6個(gè)在高溫、低溫、鹽和干旱處理下的表達(dá)模式，但未對(duì)其基因功能進(jìn)行深入研究。本課題組前期通過轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)，受冷馴化強(qiáng)烈誘導(dǎo)，但該基因在Liu等[16]的報(bào)道中并未提及，并且在冷馴化過程中，該基因在抗寒品種和敏感品種中差異表達(dá)[17]，暗示該基因在調(diào)控茶樹的低溫響應(yīng)中發(fā)揮重要作用。為明確CsSnRK3.9/CIPK12的調(diào)控機(jī)制，課題組前期以CsSnRK3.9/CIPK12為誘餌篩選了茶樹低溫處理葉片cDNA的酵母文庫(kù)，得到其候選互作蛋白CsSnRK1.1/KIN10。本研究在此基礎(chǔ)上，對(duì)CsSnRK3.9/CIPK12和CsSnRK1.1/KIN10進(jìn)行了生物信息學(xué)分析以及低溫等處理下的表達(dá)模式分析，同時(shí)進(jìn)一步明確了兩個(gè)蛋白的互作關(guān)系，這為深入研究CsSnRK3.9/CIPK12和CsSnRK1.1/KIN10在茶樹抗逆中的作用機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗(yàn)所用茶樹為國(guó)家級(jí)茶樹品種龍井43、大面白和浙農(nóng)12。試驗(yàn)所需Yeastmaker? Yeast Transformation System 2和Matchmaker Gold Yeast Two-Hybrid System試劑盒，pGADT7和pGBKT7載體購(gòu)自Clontech公司；PrimeScript RT Reagent試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司；LightCycler?480 SYBR?Green I Master試劑盒購(gòu)自Roche公司；克隆載體pEASY-bluntzero載體購(gòu)自TransGen公司；KOD酶購(gòu)于ThermoFisher公司；RNA prep Pure多糖多酚植物總 RNA提取試劑盒購(gòu)自TIANGEN公司；大腸桿菌（）菌株DH5，酵母菌株Y2H和Y187為實(shí)驗(yàn)室保存的菌株。

1.2 處理方法

自然冷馴化的樣品為采取的龍井43、大面白和浙農(nóng)12葉片，采摘時(shí)間為2016年10月至2017年3月期間，樣品處理方法參考文獻(xiàn)[17]。低溫（4℃）處理：將6年生的茶樹龍井43盆栽植株移入人工氣候室（光周期：12?h光照/12?h黑暗；恒溫：22℃；相對(duì)濕度：75%）適應(yīng)性生長(zhǎng)30?d，隨后將溫度降至4℃進(jìn)行低溫處理，在處理0?h、3?h、6?h、1?d、3?d、5?d、7?d以及將溫度升回22℃恢復(fù)生長(zhǎng)2?d時(shí)分別采集一芽一葉新梢和第三片成熟葉。試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，每2株茶樹作為1個(gè)生物學(xué)重復(fù)。采集的樣品經(jīng)液氮速凍后于–80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

ABA處理：參考Cao等[18]的處理方法，選取大小一致，健康的龍井43一年生扦插苗，于人工氣候室中進(jìn)行水培適應(yīng)培養(yǎng)30?d，營(yíng)養(yǎng)液配方參照Ruan等[19]的方法，pH值為5.0，水培槽中24?h不間斷通氧。適應(yīng)培養(yǎng)后，將茶苗置于含100?μmol·L-1ABA的營(yíng)養(yǎng)液中處理，在處理0?h，3?h，9?h，1?d，3?d和5?d時(shí)采集第二、三片成熟葉。試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，每2株茶苗作為1個(gè)生物學(xué)重復(fù)。采集的樣品經(jīng)液氮速凍后于–80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

蔗糖和葡萄糖處理：以一年生龍井43扦插苗為材料，經(jīng)過30?d水培適應(yīng)培養(yǎng)后進(jìn)行糖處理（光周期：12?h光照/12?h黑暗；恒溫：22℃；相對(duì)濕度：75%）。設(shè)置3種處理，分別為不加糖對(duì)照，3%蔗糖和3%葡萄糖。在處理3?h、9?h、12?h、1?d和2?d時(shí)，分別采集3種處理下的茶樹的第二、三片成熟葉。試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，每2株茶苗作為1個(gè)生物學(xué)重復(fù)。采集的樣品經(jīng)液氮速凍后于–80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 RNA提取以及cDNA合成

總RNA提取使用RNA prep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒。取1?μg RNA，使用PrimeScript RT Reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，儲(chǔ)存于–20℃冰箱備用。

1.4 基因克隆與載體構(gòu)建

參照已發(fā)表的舒茶早基因組序列信息[20]，利用Oligo 7.0設(shè)計(jì)引物，以龍井43的cDNA為模板，使用KOD酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，回收目的條帶，連接至pEASY-bluntzero載體，轉(zhuǎn)化至DH5后進(jìn)行鑒定并測(cè)序，陽(yáng)性克隆提取質(zhì)粒，經(jīng)雙酶切連接法分別構(gòu)建pGBKT7-CsCIPK12和pGADT7-CsKIN10終載體。PCR所用引物信息見表1（下劃線為酶切位點(diǎn)）。

表1 RT-PCR和qRT-PCR引物

注：下劃線表示相應(yīng)的酶切位點(diǎn)，GGAATTC表示EcoRⅠ酶切位點(diǎn)，CGGGATCC表示BamHⅠ酶切位點(diǎn)

Note: Underline indicates the corresponding restriction sites, GGAATTC and CGGGATCC indicates EcoR Ⅰ and BamH Ⅰ restriction site, respectively

1.5 生物信息學(xué)分析

從植物基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中下載擬南芥（http://www.arabidopsis.org/index.jsp），水稻（http://rice.plantbiology.msu.edu），和楊樹（http://www.phytozome.net/poplar）的CIPK家族和SnRK1家族的蛋白序列信息，利用ClustalX和DNAMAN進(jìn)行序列同源比對(duì)，用MEGA 7.0中的鄰接法（Neighbor-Joining）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。預(yù)測(cè)蛋白分子量、等電點(diǎn)、氨基酸組分、亞細(xì)胞定位、蛋白結(jié)構(gòu)域和蛋白磷酸化位點(diǎn)參考錢文俊等[21]的方法。

1.6 酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)

酵母感受態(tài)的制備以及酵母轉(zhuǎn)化方法按照Clontech的Yeast Protocols Handbook中的方法進(jìn)行操作。將構(gòu)建好的pGADT7-CsKIN10載體轉(zhuǎn)入Y187菌株，將構(gòu)建好的pGBKT7-CsCIPK12載體轉(zhuǎn)入Y2H菌株，于30℃倒置暗培養(yǎng)。待菌落長(zhǎng)出后，將轉(zhuǎn)化到Y(jié)2H和Y187菌株中的陽(yáng)性單克隆挑出，加入500?μL 2×YPDA培養(yǎng)液中，在30℃、200?r·min-1條件下振蕩培養(yǎng)8~12?h，并稀釋至OD600=0.2，再依次稀釋10倍、100倍，取10?μL點(diǎn)到SD/-Leu/-Trp，SD/-Leu/-Trp/-Ade/-His，SD/-Leu/-Trp/-Ade/-His /X-α-Gal/AbA篩選培養(yǎng)基上，30℃暗培養(yǎng)3?d后拍照記錄。

1.7 CsCIPK12和CsKIN10的表達(dá)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 序列結(jié)構(gòu)與進(jìn)化分析

2.1.1的序列分析

從茶樹品種龍井43中克隆得到的目的基因（TEA016252.1）的開放閱讀框?yàn)??578?bp，編碼526個(gè)氨基酸。與擬南芥，水稻和楊樹中親緣關(guān)系較近的CIPK氨基酸序列進(jìn)行同源比對(duì)發(fā)現(xiàn)，CsCIPK12的氨基酸序列與其他3種植物的氨基酸序列有較高的保守性，具有兩個(gè)重要的結(jié)構(gòu)域，分別是N端蘇氨酸/絲氨酸激酶結(jié)構(gòu)域和C端調(diào)控域，C端調(diào)控域中還有與CBLs結(jié)合所必需的NAF/FISL結(jié)構(gòu)域（圖1）。

2.1.2的序列分析

從茶樹品種龍井43中克隆得到的目的基因（TEA007220.1）的開放閱讀框?yàn)??545?bp，編碼515個(gè)氨基酸。與擬南芥，水稻和楊樹中親緣關(guān)系較近的SnRK氨基酸序列進(jìn)行同源比對(duì)發(fā)現(xiàn)，CsKIN10蛋白與其他3種植物的蛋白一樣，具有3個(gè)重要的結(jié)構(gòu)域，分別是N端蘇氨酸/絲氨酸激酶結(jié)構(gòu)域和C端調(diào)控域，以及1個(gè)與泛素結(jié)合相關(guān)的UBA結(jié)構(gòu)域（圖2）。

2.1.3 進(jìn)化分析

查找擬南芥，水稻和楊樹中的CIPK和SnRK1家族的蛋白序列，與目的蛋白一起，使用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，發(fā)現(xiàn)CsCIPK12與楊樹的PtCIPK17、18、19以及擬南芥AtCIPK12親緣關(guān)系最近，CsKIN10與楊樹的兩個(gè)SnRK1親緣關(guān)系最近（圖3）。

2.2 蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析與預(yù)測(cè)

用ProtParam預(yù)測(cè)CsCIPK12蛋白分子量為130.1?kD，理論等電點(diǎn)pI為5.01，用Cell-Ploc 2.0對(duì)該蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)，預(yù)測(cè)其定位于細(xì)胞質(zhì)中，用NetPhos 3.1預(yù)測(cè)蛋白的磷酸化位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)該蛋白可能存在50個(gè)蘇氨酸Thr磷酸化位點(diǎn)。CsKIN10蛋白分子量為58.9?kD，理論等電點(diǎn)pI為8.43，利用Cell-PLoc 2.0對(duì)該蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析，預(yù)測(cè)該蛋白定位于細(xì)胞核內(nèi)。用NetPhos 3.1對(duì)該蛋白的磷酸化位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)顯示，該蛋白可能存在33個(gè)磷酸化位點(diǎn)，其中包含15個(gè)絲氨酸Ser位點(diǎn)，11個(gè)蘇氨酸Thr位點(diǎn)和7個(gè)絡(luò)氨酸Tyr位點(diǎn)。

注：黑線之間的氨基酸序列為N端蛋白激酶結(jié)構(gòu)域；藍(lán)色線條為C端調(diào)控結(jié)構(gòu)域；紅色方框?yàn)镹AF/FISL結(jié)構(gòu)域，可以結(jié)合CBLs

注：黑線之間的氨基酸序列為N端蛋白激酶結(jié)構(gòu)域；藍(lán)色線條為C端調(diào)控結(jié)構(gòu)域；橘色線條為UBA結(jié)構(gòu)域，與泛素相關(guān)

注：使用全長(zhǎng)的氨基酸序列構(gòu)建擬南芥、水稻、楊樹和CsCIPK12及CsKIN10蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹。AtCIPKs：擬南芥；OsCIPKs：水稻；PtCIPKs：楊樹；AtSnRK1s：擬南芥；OSKs：水稻；（Pt）：楊樹

2.3 酵母雙雜明確CsCIPK12與CsKIN10的蛋白互作

按照1.6章節(jié)中的方法進(jìn)行共培養(yǎng)轉(zhuǎn)化點(diǎn)板后，SD/-Leu/-Trp培養(yǎng)基上長(zhǎng)出白色菌落，可見，陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照、（pGADT7空載體+pGBKT7-CsCIPK12）和（pGADT7-CsKIN10+pGBKT7-CsCIPK12）在酵母中成功表達(dá)且菌株活力一致。pGBKT7-CsCIPK12與pGADT7載體的共培養(yǎng)酵母不能在SD/-Leu/-Trp/-Ade/-His和SD/-Leu/-Trp/-Ade/-His/X--Gal/AbA上生長(zhǎng)，說明pGBKT7-CsCIPK12不具有自激活活性。而pGBKT7-CsCIPK12與pGADT7- CsKIN10的共培養(yǎng)酵母能夠在SD/-Leu/-Trp/-Ade/-His和SD/-Leu/-Trp/-Ade/-His/X--Gal/AbA長(zhǎng)出與正對(duì)照一樣的正常的菌落，且在SD/-Leu/-Trp/-Ade/-His/X-α-Gal/AbA上呈現(xiàn)藍(lán)色，表明pGADT7-CsKIN10與pGBKT7-CsCIPK12存在互作，并能激活下游報(bào)告基因和的表達(dá)（圖4）。

2.4 表達(dá)分析

2.4.1和受低溫誘導(dǎo)

檢測(cè)在自然冷馴化過程中3個(gè)不同抗寒性品種龍井43、大面白和浙農(nóng)12[17]葉片中的表達(dá)，qRT-PCR結(jié)果顯示，隨著溫度的降低，的表達(dá)水平顯著上升，且在抗性品種龍井43、敏感品種大面白和浙農(nóng)12中的誘導(dǎo)倍數(shù)不同。溫度較低的12月16日，在龍井43、大面白和浙農(nóng)12中的誘導(dǎo)倍數(shù)分別約為2.3、2.4倍和2.8倍，在1月17日，在3個(gè)品種中的誘導(dǎo)倍數(shù)分別約為2.0、2.7倍和2.2倍。隨著溫度的回升，的表達(dá)水平在2、3月份回落，說明參與了茶樹冷馴化過程（圖5-A）。本課題組前期在此樣品中檢測(cè)了的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)受到低溫誘導(dǎo)[17]，且在這3個(gè)品種中的表達(dá)趨勢(shì)與較為一致。

注：將CsCIPK12和CsKIN10的CDS分別克隆到pGADT7和pGBKT7載體中。pGADT7-T+pGBKT7-p53為陽(yáng)性對(duì)照，pGADT7-T+pGBKT7-lam為陰性對(duì)照，pGADT7 +pGBKT7-CsCIPK12為自激活驗(yàn)證

為了進(jìn)一步研究這兩個(gè)基因在低溫下的表達(dá)情況，我們?cè)谌斯夂蚴覂?nèi)對(duì)龍井43盆栽苗進(jìn)行了4℃短時(shí)低溫處理，qRT-PCR結(jié)果顯示，隨著處理時(shí)間的增加，在成熟葉中的表達(dá)在處理1?d及以后顯著提高，在5?d和7?d時(shí)達(dá)到最高，約為0?h的4.0倍，恢復(fù)22℃常溫處理2?d后，其表達(dá)量又下調(diào)到處理前水平。然而在新梢中，的表達(dá)對(duì)低溫并無顯著響應(yīng)（圖5-B）。與不同，處理7?d時(shí)，在新梢中的表達(dá)顯著上調(diào)，但誘導(dǎo)倍數(shù)只為處理前的1.5倍左右。在成熟葉中，的表達(dá)在處理3?h和7?d的時(shí)候顯著上調(diào)，分別為處理前的2.3倍左右和2.1倍左右（圖5-C）。此結(jié)果表明，在成熟葉中，和的表達(dá)都能迅速地響應(yīng)低溫且受低溫誘導(dǎo)，而在新梢中，和在短時(shí)間內(nèi)對(duì)低溫的響應(yīng)并不顯著。

2.4.2和受ABA誘導(dǎo)

ABA處理的qRT-PCR結(jié)果顯示，的表達(dá)受ABA處理誘導(dǎo)，且在處理3?h、1?d和5?d時(shí)的表達(dá)量顯著提高，分別約為處理前相應(yīng)數(shù)值的3.4、6.9倍和4.1倍。的表達(dá)也受ABA處理誘導(dǎo)，在處理1?h、9?h和1?d時(shí)的表達(dá)量顯著提高，分別約為處理前的3.8、3.5倍和3.5倍。此結(jié)果表明，和的表達(dá)均受ABA誘導(dǎo)，可能與ABA依賴的抗逆調(diào)節(jié)有關(guān)（圖6）。

注：*和**分別表示與Oct.14相比，差異顯著（P<0.05）和極顯著（P<0.01）；新梢和成熟葉的統(tǒng)計(jì)分析獨(dú)立進(jìn)行，不同小寫字母表示在0.05水平上差異達(dá)顯著；re2?d指恢復(fù)22℃常溫處理2?d

2.4.3和受葡萄糖和蔗糖誘導(dǎo)

葡萄糖和蔗糖處理的qRT-PCR結(jié)果顯示，與每個(gè)時(shí)間點(diǎn)未施加處理的對(duì)照相比，在葡萄糖處理1?d時(shí)的表達(dá)量顯著提高，為對(duì)照的2.0倍左右；在蔗糖處理9?h及以后的時(shí)間內(nèi)表達(dá)量均顯著提高，處理1?d后的誘導(dǎo)倍數(shù)最高，約為對(duì)照的2.3倍（圖7）。的表達(dá)在葡萄糖處理1?d后顯著上調(diào)，為對(duì)照的3.6倍左右；在蔗糖處理12?h和1?d時(shí)表達(dá)量顯著上調(diào)，分別約為對(duì)照的2.1倍和2.9倍。這些結(jié)果說明與都不同程度地受葡萄糖和蔗糖的誘導(dǎo)，這兩個(gè)基因可能參與調(diào)控植物的糖代謝途徑或糖信號(hào)途徑。

3 討論

3.1 CsCIPK12與CsKIN10互作

SnRK家族基因在代謝和脅迫信號(hào)傳遞中發(fā)揮重要作用，調(diào)控植物對(duì)逆境脅迫的響應(yīng)[1]。目前，關(guān)于SnRK1亞家族成員與SnRK3亞家族成員互作關(guān)系的研究，僅在擬南芥和水稻中有報(bào)道。AtCIPK14與AtSnRK1.1/1.2互作[8]，調(diào)控糖響應(yīng)。OsCIPK15與OsSnRK1A互作并正調(diào)控OsSnRK1A，提高水稻對(duì)淹水脅迫的耐受性[12]。本研究通過酵母雙雜交試驗(yàn)，證實(shí)了茶樹SnRK蛋白家族中的CsCIPK12與CsKIN10互作（圖4），這豐富了SnRK1蛋白亞家族和SnRK3蛋白亞家族成員間的互作關(guān)系網(wǎng)絡(luò)，為深入研究?jī)蓚€(gè)SnRK蛋白亞家族成員的功能提供了理論依據(jù)和研究思路。關(guān)于CsCIPK12和CsKIN10具體的調(diào)控關(guān)系，磷酸化作用位點(diǎn)以及下游的磷酸化靶標(biāo)蛋白等問題，值得進(jìn)一步深入研究。

注：不同小寫字母表示在0.05水平上差異達(dá)顯著

注：圖中不同的小寫字母表示與每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的對(duì)照相比，在0.05水平上差異達(dá)顯著

3.2 CsCIPK12與CsKIN10受低溫誘導(dǎo)

冷馴化過程中，[17]與均受低溫誘導(dǎo)，且在抗寒品種龍井43中的表達(dá)均低于兩個(gè)敏感品種浙農(nóng)12和大面白，表明和在低溫脅迫下可能存在協(xié)同作用的關(guān)系（圖5-A）。短時(shí)低溫處理下，成熟葉中對(duì)低溫的響應(yīng)先于，且的表達(dá)量在處理3?h后誘導(dǎo)至最高水平，說明在茶樹早期響應(yīng)低溫中發(fā)揮作用（圖5-B，圖5-C）。和基因在成熟葉中受低溫強(qiáng)烈誘導(dǎo)，而在新梢中，不受低溫調(diào)控，僅在處理7?d時(shí)表達(dá)有所提高，但也未達(dá)到2倍。先前研究表明，茶樹成熟葉和新梢的耐冷機(jī)制存在差異，低溫條件下，成熟葉中與細(xì)胞膜、氧化還原過程、谷胱甘肽代謝和光合作用途徑有關(guān)的基因表達(dá)上調(diào)，而新梢中與細(xì)胞膜、類胡蘿卜素代謝、光合作用和ROS解毒有關(guān)的基因表達(dá)受到抑制[24]。在茶樹新梢中不響應(yīng)低溫，但在成熟葉中，和受低溫顯著誘導(dǎo)，作者認(rèn)為可能是茶樹新梢較成熟葉可積累更多的茶多酚，而茶多酚可以清除細(xì)胞中的ROS，由此造成了部分基因（如依賴ROS信號(hào)途徑基因）在成熟葉和新梢中對(duì)低溫的差異響應(yīng)[25]。因此，我們推測(cè)冷脅迫下，茶樹新梢中較高的茶多酚含量影響了和的低溫響應(yīng)表達(dá)，和可能在茶樹新梢和成熟葉對(duì)低溫的差異響應(yīng)機(jī)制中發(fā)揮作用（圖5-B，圖5-C）。

目前，已有研究證實(shí)了部分參與調(diào)控植物的低溫響應(yīng)。受低溫誘導(dǎo)，AtCIPK7與AtCBL1互作調(diào)控?cái)M南芥的低溫響應(yīng)[26]；受低溫誘導(dǎo)，正調(diào)控水稻的抗寒性[27]；受低溫誘導(dǎo)，超表達(dá)的水稻抗寒性增加[28]。但它們的具體調(diào)控機(jī)制，除CBL以外的互作蛋白的鑒定及下游目標(biāo)基因都尚不明確。本研究鑒定的，其表達(dá)受低溫強(qiáng)烈誘導(dǎo)，而且CsCIPK12能與CsKIN10激酶互作，這為研究CIPK和KIN參與調(diào)控植物的低溫響應(yīng)機(jī)制提供了新的思路。

3.3 CsCIPK12與CsKIN10響應(yīng)低溫的途徑

ABA是重要的信號(hào)化合物，參與多種非生物脅迫的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，進(jìn)而調(diào)節(jié)植物的脅迫耐受性[29]。先于對(duì)ABA做出響應(yīng)（圖6），這與低溫處理結(jié)果相一致，說明可能在茶樹響應(yīng)非生物脅迫的早期發(fā)揮重要作用。ABA在低溫脅迫下發(fā)揮重要作用，其中，冷處理使擬南芥中ABA含量短暫增加[30]；冷馴化使番茄中ABA的生物合成顯著提高[31]；外源ABA的施加可以改變冷相關(guān)基因和的表達(dá)，通過維持細(xì)胞膜穩(wěn)定性、改善光系統(tǒng)Ⅱ過程、增加冷脅迫下碳同位素分餾等途徑增強(qiáng)百慕達(dá)草的抗寒性[32]。同時(shí)，在擬南芥和其他植物中，有研究證明參與ABA信號(hào)通路[11,33-34]。因此，我們推測(cè)和可能通過ABA信號(hào)途徑調(diào)控茶樹的低溫脅迫。

在非生物脅迫下，植物體內(nèi)的可溶性糖含量增加，糖不僅作為滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)來維持細(xì)胞滲透勢(shì)，而且作為信號(hào)分子來調(diào)控脅迫相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，從而調(diào)控植物的抗逆性。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，糖代謝途徑和鈣離子信號(hào)途徑是茶樹響應(yīng)冷馴化獲得抗寒性的主要途徑[14]，而后明確了可溶性糖如蔗糖和葡萄糖等在茶樹冷馴化過程中顯著積累，糖信號(hào)和糖代謝相關(guān)基因的表達(dá)也發(fā)生了顯著變化[35]。過表達(dá)的擬南芥抗寒性增強(qiáng)，具有較低的蔗糖和果糖含量、較高的淀粉含量和較強(qiáng)的蔗糖代謝關(guān)鍵酶活性，表達(dá)水平也顯著提高[36]，這表明參與糖信號(hào)及低溫脅迫信號(hào)途徑。與均能響應(yīng)葡萄糖和蔗糖處理（圖7），暗示這兩個(gè)基因通過糖代謝或糖信號(hào)途徑參與植物的低溫脅迫響應(yīng)。此外，SnRK1在糖信號(hào)傳導(dǎo)和代謝調(diào)控中的報(bào)道屢見不鮮，而CIPK的相關(guān)研究較少。本研究挖掘到了一個(gè)新的CIPK基因，受葡萄糖和蔗糖的誘導(dǎo)（圖7-A），這為研究CIPK家族基因在糖信號(hào)通路以及代謝調(diào)控的分子機(jī)制提供了借鑒。

植物對(duì)非生物逆境表現(xiàn)出各種各樣的反應(yīng)，其體內(nèi)必然存在著不同信號(hào)通路之間的串?dāng)_，但是也存在特定的非生物應(yīng)激信號(hào)反應(yīng)[37]。本研究表明，和可能參與ABA和糖等信號(hào)途徑，調(diào)控茶樹的低溫脅迫響應(yīng)。

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Interaction Identification and Expression Analysis of CsCIPK12 and CsKIN10 in Tea Plant

FENG Xia, DI Taimei, PENG Jing, LI Nana, YAO Lina, YANG Yajun, WANG Xinchao*, WANG Lu*

Tea Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences / National Center for Tea Improvement/Key Laboratory of Tea Biology and Resource Utilization, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Hangzhou 310008, China

Sucrose non-fermenting 1-related protein kinase (SnRK) plays important roles in metabolic regulation and stress signal transduction. In this study,gene of the SnRK3 subfamily andgene of the SnRK1 subfamily in tea plant were used as research objects. Protein sequence alignment and phylogenetic tree analysis showed that both CsCIPK12 and CsKIN10 have an N-terminal kinase domain and a C-terminal regulatory domain; CsCIPK12 has a NAF/FISL domain that binds to CBLs, and is homologous with AtCIPK12 inand PtCIPK17, 18, and 19 in poplar; CsKIN10 has the ubiquitin-related UBA domain and is homologous with PtSnRK1 in poplar. Yeast two-hybrid analysis showed that CsCIPK12 could interact with CsKIN10. Expression analysis found that the expression ofwas induced by natural cold acclimation to varying degrees in the three tea cultivars ‘Longjing 43’, ‘Zhenong 12’ and ‘Damianbai’, which was consistent with the results of the previous study on. Under 4℃ cold stress, the expressions ofandwere significantly up-regulated in mature leaves (the highest induction levels were 4-fold and 2.3-fold, respectively), while in the shoots, the responses ofandto the cold stress were not significant. Under ABA, glucose and sucrose treatments, the expression levels ofandwere significantly up-regulated in mature leaves. These results suggest that CsCIPK12 interacts with CsKIN10, which are involved in ABA and sugar signaling pathways and may play an important role in cold response in tea plants.

tea plant, CIPK12/SnRK3.9, KIN10/SnRK1.1, cold stress, yeast two-hybrid

S571.1；Q946.84+1；Q939.1

A

1000-369X（2020）06-739-12

2020-04-20

2020-05-13

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31870685）、中央級(jí)科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)（1610212018007）、現(xiàn)代農(nóng)業(yè)（茶葉）產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS-19）

馮霞，女，碩士研究生，主要從事茶樹遺傳育種與抗逆機(jī)理研究。*通信作者：xcw75@tricaas.com；wanglu317@tricaas.com