補陽還五湯對腦缺血后大鼠腦神經功能的影響

陳云歡 吳旋 江一靜

缺血性腦卒中是一種高發病率、高致死率的疾病，腦缺血動物模型用于缺血性腦卒中治療的療效評價已有20 年的歷史。腦缺血后神經元受損包括很多病理生理因素，如興奮性氨基酸毒性、氧化應激、炎癥反應和細胞凋亡等。補陽還五湯由黃芪、赤芍、川芎、當歸、地龍、桃仁、紅花七藥組成，是治療氣虛血瘀型腦卒中的經方、名方，具有補氣、活血、通絡之效，補陽還五湯在臨床上治療腦缺血療效顯著[1]，然而其作用機制尚不明確。采用大鼠制備局灶性腦缺血模型是目前研究缺血性腦損傷發生機制及干預效果的重要手段[2]。自噬參與了生命體很多重要的過程，它一方面可以維持細胞內環境的穩態，而另一方面亦可加速細胞死亡。在腦缺血性損傷后，自噬對神經元兼具著神經保護和促進死亡的雙重作用。腦血管內皮細胞自噬作為一種重要的神經系統調控靶點，在補陽還五湯治療腦缺血中起著重要的調節作用。LAMP2 是一種溶酶體相關膜蛋白，作為CMA 的標志性蛋白，它的表達水平直接決定了CMA 的活性。本實驗采用改良線栓法制備大鼠腦缺血-再灌注模型[3]，用補陽還五湯進行灌胃治療，觀察自噬-溶酶體信號通路的LAMP2 的表達情況，從細胞自噬角度探討補陽還五湯改善腦缺血的作用機制。

1 資料與方法

1.1 一般資料

成年Wistar 大鼠50 只，雄性，100 ～150 g，購自福建中醫藥大學動物實驗中心。50 只大鼠隨機分成四組：（1）正常對照組：10 只，假手術后，常規飼養于籠內，不進行任何干預治療。（2）模型組：10 只，造模后常規飼養于籠內，不進行任何干預治療。（3）補陽還五湯低劑量組：10 只，2.5 g/（kg·只）（按體表面積計算相關于成人劑量的0.5 倍），1 次/d，造模前灌胃7 d，造模后繼續灌胃7 d。（4）補陽還五湯中劑量組：10 只，5 g/（kg·只）（按體表面積算相當于成人等效劑量），1 次/d，造模前灌胃7 d，造模后繼續灌胃7 d。（5）補陽還五湯高劑量組：10只，25 g/（kg·只）（按體表面積算相當于成人等效劑量的5 倍），1 次/d，造模前灌胃7 d，造模后繼續灌胃7 d。

1.2 研究方法

1.2.1 補陽還五湯制備 各單味藥購自北京康仁堂藥業有限公司，嚴格遵照原方配比而成，由福建中醫藥大學附屬康復醫院藥劑科完成，置于4 ℃下冷藏備用。

1.2.2 動物模型制備 術前禁食12 h，用3.4%水合氯醛腹腔注射麻醉后，仰臥位固定于手術臺上，采用改良線栓法制備大鼠大腦中動脈栓塞模型，術后2 h 對大鼠進行神經行為學評價。以Longa 5 級4 分法評價模型的神經功能缺失癥狀。神經功能評分后斷頭取出鼠腦。

1.2.3 實時熒光定量PCR 擴增 大鼠腦組織RNA 提取采用trizol 法，試劑購于thermo 賽默飛公司。

1.2.4 LAMP2 的引物設計 選擇Rat 的GAPDH 為內參基因，依據實時熒光定量PCR（SYBR 法）引物設計原則，根據NCBI 登錄的GAPDH 基因mRNA 序列和大鼠的LAMP2 基因mRNA 序列，用Primer Premier 5.0 設計目標基因和內參基因的特異性引物，用Oligo 6.0 檢驗其特異性。引物（上海生工公司）序列為：

按下列組分配制PCR 反應液，配制反應液時先配制總的反應液，再各個分裝。配制過程均在冰上進行。每個反應重復三次，設計實驗組和陰性對照。PCR 反應的程序設置：94℃ 30sec；94℃5sec；60℃34sec，共40 個循環。各組樣本采用△Ct 進行基因相對表達差異檢驗，P＜0.05 差異具有統計學意義；目的基因的相對表達量計算方法為2-△△Ct[4]。詳見表1。

1.3 觀察指標

mRNA 相對定量：各組樣本采用△Ct 進行基因相對表達差異檢驗，各基因的mRNA 實際表達量與△Ct 值呈反比，即mRNA表達量越多，表明△Ct 值越小。P＜0.05 差異具有統計學意義，目的基因的相對表達量計算方法為2-△△Ct[4]。

1.4 數據收集處理與分析

數據用用SPSS 19.0 軟件分析，多組間數據差異比較采用單因素方差分析和多個樣本均數間的多重比較，采用（±s）表示，以P＜0.05 為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 補陽還五湯對大鼠神經功能的影響

術后2 h模型組、低劑量組、中劑量、高劑量組與假手術組比較，差異具有統計學意義（P＜0.01）。模型組、低劑量組、中劑量組、高劑量組各組間比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。術后第7 天，補陽還五湯灌胃治療后大鼠神經功能得到一定程度的恢復。模型組、低劑量組、中劑量組、高劑量組與假手術組比較差異具有統計學意義（P＜0.01）。模型組與低劑量組比較差異無統計學意義（P＞0.05），與中劑量組和高劑量組比較差異具有統計學意義（P＜0.05）。低劑量組與中劑量組比較差異無統計學意義（P＞0.05），與高劑量組比較差異具有統計學意義（P＜0.01）。中劑量組與高劑量組比較差異無統計學意義（P＞0.05），見表2。

2.2 實時熒光定量PCR 結果

各組之間mRNA 擴增表達兩兩間比較差異具有統計學意義（P＜0.01），見表3。以模型組為對照組，按2-△△Ct規則計算各組的LAMP2 mRNA 相對表達量，如圖1 示，正常組、低劑量組、中劑量組、高劑量組mRNA 相對表達水平較模型組均上調（均P＜0.01）。正常組表達量最高，高劑量組高于中劑量組，中劑量組高于低劑量組。以正常組為對照組，按2-△△Ct規則計算各組的LAMP2 mRNA 相對表達量，如圖2 示，高劑量組大于中劑量組，中劑量組大于低劑量組，低劑量組大于模型組（均P＜0.01）。

3 討論

腦缺血導致神經功能損傷的機制復雜，與多種機制有關。缺血再灌注后，大鼠腦部缺血缺氧誘發興奮性氨基酸（EAA）毒性作用、一氧化氮（NO）細胞毒效應、調控凋亡相關基因表達等因素[5-6]可致神經功能受損。此外，細胞自噬在其中也扮演了重要角色，自噬是細胞程序性調控的重要生命活動之一。在哺乳動物低氧缺血、局灶性腦缺血或全腦缺血的模型中，都可誘發神經元自噬[7-8]。細胞在缺氧情況下可激活自噬，通過降解損傷蛋白提供能量，并合成新的蛋白，對神經細胞起保護作用。研究認為細胞自噬能夠縮小缺血再灌注后病變大腦體積，緩解腦水腫，減少神經元死亡，改善神經功能和行為損傷，起到減輕神經細胞受損的作用。然而，自噬的過度活化可能會導致細胞自體消化并誘發神經元死亡，加重腦損傷程度[9-11]。

自噬-溶酶體途徑能為重要細胞功能提供營養物質，還能清除多余或損傷的細胞器、錯誤折疊蛋白及入侵的微生物，有利于神經功能恢復及內環境的穩定[12]。哺乳動物的自噬-溶酶體途徑有三種形式：大自噬（macroautophagy）、小自噬（microautophagy）以及分子伴侶介導的自噬（chaperone- mediatedautophagy，CMA）[13]。其中CMA 途徑能在熱休克蛋白（HSC70）等分子伴侶的介導下特異性地識別異常的蛋白質，將其運送到溶酶體膜上，溶酶體膜表達跨膜蛋白LAMP-1 和LAMP-2，兩者在功能上可相互代償。LAMP-2 是一種糖基化1 型膜蛋白，作為主要的溶酶體膜蛋白，直接參與了中性粒細胞的黏附、抗原提呈和分子伴侶性自噬。LAMP2 作為CMA 的標志性蛋白，其在溶酶體膜上的表達水平直接決定了CMA 的活性[14-15]。

表1 各試劑名稱和使用量

表2 補陽還五湯對大鼠神經功能評分的影響（±s）

表2 補陽還五湯對大鼠神經功能評分的影響（±s）

注：1）與假手術組比較P ＜0．01；2）與中劑量比較，P ＜0．05，其中模型組與中劑量組比較，Z=-2．046，P=0．041；3）與高劑量比較，P ＜0．01，其中模型組與高劑量組比較，Z=-3．421，P=0．001；低劑量組與與高劑量組比較，Z=-3．31，P=0．001

組別 術后2 h 術后7 d假手術組 0 0模型組 2．17±0．51） 2．11±0．541）2）3）低劑量組 2．28±0．561） 1．94±0．461）3）中劑量組 2．17±0．431） 1．5±0．401）高劑量組 2．22±0．511） 1．11±0．301）

表3 各組LAMP2 mRNA 擴增的△Ct（±s）

表3 各組LAMP2 mRNA 擴增的△Ct（±s）

組別 例數 △Ct正常 8 0．665±0．084模型 8 2．684±0．128低劑量 8 2．091±0．115中劑量 8 1．655±0．098高劑量 8 1．110±0．053

圖1 LAMP2 mRNA 的相對表達水平

圖2 LAMP2 mRNA 相對表達量

補陽還五湯是我國治療缺血性腦卒中的傳統名方，臨床療效確切。本研究中，采用改良線栓法制備大鼠腦缺血-再灌注模型，以Longa 5 級4 分法評價模型的神經功能缺失癥狀。造模后2 小時，模型組，補陽還五湯低劑量組、中劑量組、高劑量組之間比較差異無統計學意義（P＞0.05）。造模7 天后，模型組與低劑量組，低劑量組和中劑量組，中劑量組和高劑量組之間比較差異無統計學意義（P＞0.05）。模型組與中劑量組、高劑量組比較差異具有統計學意義（P＜0.05）：低劑量組與高劑量組比較差異具有統計學意義（P＜0.01）。研究結果表現出一定的劑量依賴性，顯示補陽還五湯高劑量對大鼠腦缺血明確有效，低劑量明確無效，中劑量療效不明確，可能受樣本例數與老鼠對藥物反應與體內代謝各異有關。模型的實時熒光定量PCR 結果顯示補陽還五湯對LAMP2 mRNA 表達量影響顯著，呈現出劑量依賴趨勢。模型組、低劑量組、中劑量組、高劑量組較正常對照組LAMP2RNA 表達量均降低（P＜0.01）：低劑量組、中劑量組、高劑量組較模型組LAMP2RNA 表達量均升高；補陽還五湯低劑量組、中劑量組、高劑量組之間倆倆比較差異具有統計學意義（P＜0.01），隨著劑量的增高表達量也增加。

實驗結果表明，補陽還五湯能通過上調LAMP2 表達影響CMA 的活性，進而啟動自噬調控使腦缺血大鼠運動感覺功能恢復和減輕腦損傷。但有關補陽還五湯如何調控，經過什么信號傳導通路，有哪些細胞因子參與尚需要進一步研究。