輔助性T淋巴細胞9在慢性丙型肝炎初治患者中的變化及臨床意義

王 姣， 田元元， 梁志軍

1 海南省人民醫院， 海南醫學院附屬海南醫院 a. 感染科； b. 消化內科， 海口 570311；2 博鰲超級醫院 感染科， 海南 瓊海 571435

直接抗病毒藥物(DAA)的問世使慢性丙型肝炎的治療進入了治愈的時代，但HCV感染慢性化機制尚未完全闡明。輔助性T淋巴細胞9(Th9)是新鑒定的CD4+T淋巴細胞亞群，主要分泌IL-9，PU.1和Foxo1是誘導Th9分化的特異性轉錄因子[1-2]。Th9在病毒感染中發揮重要的免疫調控作用[3]，但Th9及其分泌的IL-9在HCV感染中的作用尚未完全闡明。因此，本研究分析了慢性丙型肝炎患者Th9水平及其與相關臨床指標的關系，觀察抗病毒對慢性丙型肝炎患者Th9水平的影響。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選取2018年12月-2019年7月于海南省人民醫院就診的慢性丙型肝炎初治患者。入組標準：(1)年齡>18歲且<65歲；(2)HCV RNA和抗-HCV陽性6個月以上；(3)入組前未使用抗病毒或免疫調節劑治療。排除標準：(1)經影像學(腹部B超、肝纖維化掃描、CT或MRI)和相關實驗室檢查綜合評估診斷為肝硬化；(2)合并其他嗜肝病毒和(或)HIV感染；(3)合并惡性腫瘤；(4)合并心臟、肺、肝臟、腎臟等重要臟器功能不全；(5)合并自身免疫性疾?。?6)孕婦及哺乳期婦女。所有入組患者均接受索磷布韋維帕他韋片(每片含有索磷布韋400 mg和維帕他韋100 mg，吉列德科學公司)1片/d口服治療，療程12周。同時，選取同期本院進行健康體檢的健康志愿者作為對照組。

1.2 病毒學和生化檢測 采用實時定量PCR法檢測血清HCV RNA，試劑盒由中山大學達安基因公司提供，檢測閾值為100拷貝/ml。采用日本Hitachi公司7170A全自動生化分析儀檢測患者肝功能，ALT參考范圍為男性12～40 U/L，女性11～35 U/L。

1.3 血漿和外周血單個核細胞(PBMC)的分離 慢性丙型肝炎患者基線和抗病毒治療結束時分別采集EDTA抗凝外周血10 ml，室溫1000 r/min離心10 min收集上層血漿，凍存于-80 ℃備用。下層血細胞使用美國Sigma公司的人淋巴細胞分離液、采用密度梯度離心法分離PBMC，調整細胞濃度至107個/ml，凍存于液氮中備用。

1.4 流式細胞術檢測T淋巴細胞分泌IL-9水平 復蘇凍存的PBMC，調整細胞濃度至106個/ml，加入佛波酯(50 ng/ml)和伊烏諾霉素(1 μg/ml)刺激細胞因子分泌，同時加入莫能霉素(10 μg/ml)抑制蛋白轉運，刺激培養6 h后收集細胞。將細胞轉入FACS管中，加入抗CD3-PerCP(美國BD公司)、抗CD4-FITC(美國BD公司)、抗CD8-APC(美國BD公司)進行表面染色，4 ℃避光孵育30 min，洗滌后加入破膜固定液，4 ℃避光孵育15 min后加入抗IL-9-PE(美國eBioscience公司)，4 ℃避光孵育30 min，洗滌后加入4%多聚甲醛/PBS固定細胞，使用美國BD公司FACS Calibur流式細胞儀、采用CellQuest Pro軟件獲取細胞，采用美國TreeStar公司FlowJo V10軟件分析結果。

1.5 ELISA檢測IL-9水平 使用武漢碧云天公司的IL-9 ELISA檢測試劑盒檢測血漿IL-9水平。將血清樣本和不同濃度的標準品以100 μl/孔加入檢測平板中，封住反應孔，室溫孵育2 h，洗板5次后加入100 μl/孔生物素化抗體，封住反應孔，室溫孵育1 h，洗板5次后加入100 μl/孔辣根過氧化物酶標記Streptavidin，封住反應孔，室溫避光孵育20 min，洗板5次后加入100 μl/孔TMB顯色劑，封住反應孔，室溫避光孵育15 min，帶標準品出現顯著顏色變化時加入50 μl/孔終止液，混勻后立即測量A450值，繪制標準曲線，計算血漿中IL-9濃度。

1.6 反轉錄實時定量PCR法檢測PBMC中IL-9、PU.1和Foxo1 mRNA水平 應用德國Qiagen公司RNA提取試劑盒提取PBMC中總RNA。反轉錄體系(TaKaRa公司PrimeScript反轉錄試劑盒)：5×緩沖液 2 μl，反轉錄酶混合物I 0.5 μl，寡聚胸腺嘧啶引物 0.5 μl，隨機六核苷酸引物 0.5 μl，總RNA 1 μg，加入不含RNA酶的去離子水調整反應體積至10 μl。反轉錄反應條件：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。實時定量PCR反應體系(TaKaRa公司TB Green實時定量PCR試劑盒)：TB Green預混Taq酶 10 μl，ROX參考染料 0.4 μl，上游引物(10 μmol/L) 0.4 μl，下游引物(10 μmol/L) 0.4 μl，cDNA 2 μl，滅菌水 6.8 μl。PCR反應條件：預變性 95 ℃ 30 s；PCR反應 95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s。PCR引物序列：IL-9上游引物：5’-CCAGCTTCC AAGTGCCACTGC-3’，IL-9下游引物：5’-TGCATGGTGGTATTGGTCATCTG-3’；PU.1上游引物：5’-GGAAGCCCGGCTGGATGTTAC-3’，PU.1下游引物：5’-CACCAGGTCTTCTGA TGGCTGA-3’；Foxo1上游引物：5’-ACAGACCAACCTGGCATTAC-3’；Foxo1下游引物：5’-TACGTCCTGATGGGACTTACA-3’；β-肌動蛋白上游引物：5’-CACGAAACTACCTTC AACTCC-3’，β-肌動蛋白下游引物：5’-CATACTCCTGCTTGCTGAATC-3’。采用2-ΔΔCt法以β-肌動蛋白為內參照對IL-9 mRNA相對表達量進行分析。

1.7 倫理學審查 本研究方案通過海南省人民醫院倫理委員會批準，批號：省醫倫審[2018]91，入組志愿者均簽署知情同意書。

2 結果

2.1 一般資料 共納入29例慢性丙型肝炎初治患者，其中9例基線ALT正常，20例基線ALT超過正常值上限，所有患者均完成了12周抗病毒治療，治療結束時均達到病毒學應答(HCV RNA低于檢測下限)，所有患者ALT水平均復常。同時納入年齡和性別比例相匹配的健康對照者15例，兩組基線臨床特征見表1。

表1 兩組基線臨床特征

2.2 兩組Th9比例、IL-9水平和IL-9 mRNA、PU.1 mRNA及Foxo1 mRNA相對表達量的比較 慢性丙型肝炎初治患者和健康對照者外周血Th9(CD3+CD4+IL-9+)典型流式散點圖見圖1，慢性丙型肝炎初治患者外周血Th9占CD4+T淋巴細胞比例明顯低于健康對照者(P<0.05)(表2)。慢性丙型肝炎初治患者血漿IL-9水平、IL-9 mRNA和PU.1 mRNA相對表達量亦明顯低于健康對照者(P值均<0.05)，但Foxo1 mRNA相對表達量在慢性丙型肝炎初治患者和健康對照者之間的差異無統計學意義(P>0.05)(表2)。而Th9比例、血漿IL-9水平和IL-9 mRNA、PU.1 mRNA及Foxo1 mRNA相對表達量在HCV基因1b型患者和2a型患者之間的差異均無統計學意義(P值均>0.05)。

2.3 慢性丙型肝炎初治患者Th9比例、IL-9水平和IL-9 mRNA、PU.1 mRNA及Foxo1 mRNA相對表達量與臨床指標的相關性 慢性丙型肝炎初治患者外周血Th9比例、IL-9水平、IL-9 mRNA和PU.1 mRNA與HCV RNA呈負相關(P值均<0.05)(圖2)，但Foxo1 mRNA與HCV RNA無明顯相關性(P>0.05)，上述指標與ALT水平均無明顯相關性(P值均>0.05)。

表2 兩組Th9比例、IL-9水平和IL-9 mRNA、PU.1 mRNA及Foxo1 mRNA相對表達量的比較

2.4 抗病毒治療對慢性丙型肝炎初治患者Th9比例、IL-9水平、IL-9 mRNA及PU.1 mRNA相對表達量的影響 所有患者完成12周抗病毒治療后外周血Th9比例和PU.1 mRNA均明顯高于基線(P值均<0.05)(表3)，但IL-9水平和IL-9 mRNA相對表達量在基線和治療結束時之間差異無統計學意義(P值均>0.05)(表3)。

表3 抗病毒治療對慢性丙型肝炎初治患者Th9比例、IL-9水平、IL-9 mRNA及PU.1 mRNA相對表達量的影響

3 討論

Th9是一種多效性的輔助性淋巴細胞，可能通過多種信號轉導通路發揮免疫保護和促進疾病進展的雙重作用[4-5]。Th9及其分泌的IL-9在多種病毒感染性疾病中均發揮重要作用。在寨卡病毒感染的早期，Th9即被活化，分泌IL-9水平顯著升高，病程至恢復期時Th9和IL-9水平復常[6]，而Th9的活化可能與中樞神經系統細胞損傷密切相關[7]。Th9和IL-9在急性和慢性HIV感染中表現出完全不同的表達譜，急性HIV感染IL-9水平顯著升高，而慢性HIV感染中IL-9水平顯著下降[8]。本研究首次檢測了慢性丙型肝炎初治患者Th9及相關轉錄因子的水平，結果發現，慢性丙型肝炎初治患者外周血Th9細胞比例、IL-9水平及IL-9 mRNA和PU.1 mRNA水平均顯著降低，且與HCV病毒載量呈顯著負相關。這與在慢性乙型肝炎患者中的研究[9]結果一致，提示高水平的病毒復制可能抑制了Th9的活化和IL-9的分泌，同時，由于Th9和IL-9水平與ALT無顯著相關性，提示Th9可能與慢性丙型肝炎初治患者的炎癥應答無關，Th9和IL-9水平降低可能不足以發揮免疫保護作用，進而誘導感染慢性化。Th9比例和IL-9水平在不同HCV基因型之間的差異無統計學意義，因此，Th9和IL-9水平的降低可能與不同HCV基因型慢性丙型肝炎患者對治療敏感性的差異無關。PU.1和Foxo1均為誘導Th9分化的重要轉錄因子， PU.1是特異性誘導CD4+T淋巴細胞分泌IL-9的細胞因子，而Foxo1不但可誘導CD4+T淋巴細胞分泌IL-9，還可抑制Th17和CD8+T淋巴細胞的分化及IL-9的分泌。因此，Foxo1并非特異性Th9的轉錄因子[10-11]。本研究發現，轉錄因子Foxo1 mRNA水平在慢性丙型肝炎初治患者和健康對照者之間的差異無統計學意義，提示Foxo1可能并非調控HCV感染者中Th9的關鍵轉錄因子，而PU.1可能是主要發揮調控HCV感染者中Th9分化和活化的作用。

DAA治療可有效控制HCV復制，在絕大多數慢性丙型肝炎患者中應用后均可達到治愈。新近研究[12]發現，DAA治療對機體的免疫應答也具有調控作用。DAA治療不但可恢復急性丙型肝炎患者HCV特異性免疫應答，還可降低慢性丙型肝炎患者外泌體相關microRNA水平，進而增強自然殺傷細胞的脫顆粒，促進殺傷功能[13]，以索磷布韋為基礎的有效抗病毒治療可抑制多種細胞因子和趨化因子的表達，抑制HCV誘導的肝臟炎癥[14]。本研究發現，經索磷布韋/維帕他韋有效抗病毒治療后，所有患者均獲得病毒學應答，Th9和PU.1 mRNA相對表達量較基線均顯著下降，但血漿IL-9水平和IL-9 mRNA相對表達量在基線和治療后的則無差異。由于Th9并非分泌IL-9的唯一細胞來源，多種免疫細胞(自然殺傷細胞、固有淋巴樣細胞2、漿細胞)均可分泌IL-9[4]，DAA治療可能無法有效恢復其他分泌IL-9的免疫細胞功能，導致IL-9水平無明顯變化，這與慢性乙型肝炎患者經恩替卡韋抗病毒治療后IL-9水平無顯著變化的結果一致[15]。但DAA治療則可有效恢復慢性HCV感染者外周血Th9活性，發揮一定的免疫調控作用。

綜上所述，慢性HCV感染可能抑制Th9活化，有效的抗病毒治療可恢復Th9水平，Th9可能參與了HCV感染慢性化。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會成員、受試者監護人以及與公開研究成果有關的利益沖突，特此聲明。

作者貢獻聲明：王姣、田元元負責實驗實施，收集數據，入組患者，撰寫論文。梁志軍負責課題設計，資料分析，修改論文。王姣負責擬定寫作思路，指導撰寫文章并最后定稿。