外周血lncRNA-LET對慢性乙型肝炎肝硬化的診斷價值

牛興杰， 劉志慧， 崔鳳梅， 劉耀敏， 王艷飛， 張國民， 劉金霞

1 承德醫學院附屬醫院 感染性疾病科， 河北 承德 067000； 2 承德醫學院 基礎醫學院， 河北 承德 067000

慢性乙型肝炎(CHB)的發病機制涉及多種炎性細胞之間的相互作用[1]。肝纖維化是肝硬化的早期可逆轉階段，目前學者研究[2]證實，在肝纖維化發展至早期肝硬化階段，若能得到及時的診斷和治療，肝纖維化甚至早期肝硬化仍是可逆的。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA, lncRNA)是一類轉錄本長度超過200 nt，同時不編碼蛋白質的一種RNA。研究[3]顯示，lncRNA參與細胞各種生命活動的不同階段，并認為其幾乎參與到涉及生命周期的每一個過程。在一些復雜疾病中，相關信號通常來源于基因的非編碼區域，目前研究[4]證實，lncRNA異常表達與人類重大疾病相關，如心血管疾病、各種癌癥、阿爾茨海默病等，lncRNA作為潛在的診斷、治療及預后指標，受到了越來越多學者的關注。本研究探討分析外周血lncRNA-LET對CHB肝硬化的診斷價值。

1 資料與方法

1.1 研究對象 本研究為前瞻性研究，選取2017年3月-2019年5月在承德醫學院附屬醫院就診的CHB患者183例，其中乙型肝炎肝硬化患者作為肝硬化組，無肝硬化病理改變患者作為非肝硬化組。同時，選擇同期在本院健康體檢的40例健康人群作為正常對照組。

1.2 納入標準和排除標準 納入標準：(1)CHB患者均符合《慢性乙型肝炎防治指南(2015年更新版)》[5]相關診斷標準；(2)CHB患者均未進行抗病毒治療；(3)納入受試者自愿簽署知情同意書。排除標準：(1)合并其他肝炎病毒感染者，如HAV、HCV、HDV；(2)合并其他特殊病毒感染者，包括巨細胞病毒、EB病毒以及HIV等；(3)合并酒精性肝病以及非酒精性脂肪性肝病、自身免疫性肝病以及藥物性肝損傷患者；(4)合并原發性或轉移性肝細胞癌以及合并其他器官腫瘤患者；(5)合并風濕免疫系統疾病，與免疫功能異常相關其他疾病等。

1.3 檢測方法

1.3.1 肝功能檢測 取3組受試者清晨空腹靜脈血2 ml，離心分離血清，置于-20 ℃冰箱內保存備用，采用放射免疫測定3組受試者肝功能指標，包括TBil、膽堿酯酶(ChE)、總膽汁酸(TBA)以及Alb。

1.3.2 外周血lncRNA-LET水平檢測 取3組受試者空腹靜脈血5 ml于EDTA抗凝管中，離心分離血清，于-80 ℃冰箱內保存備用。總RNA提取：取出樣品解凍后加入Trizol試劑，混勻后加入氯仿，震蕩，離心后取上層無色液體，加入異丙醇混勻后離心，棄去上清，加入焦碳酸二乙酯溶解。逆轉錄制備cDNA：參考逆轉錄試劑盒操作說明書進行。實時熒光定量PCR：參照熒光定量PCR試劑盒使用說明書，反應條件：95 ℃ 3 min預變性，95 ℃ 30 s變性、58 ℃ 30 s退火、72 ℃ 30 s延伸，共完成35個循環，繪制熔解曲線分析PCR產物，每孔設置3個復孔，取3個孔平均值，以GAPDH作為內參基因，以2-△△Ct表示相對表達量。lncRNA-LET上下游引物分別為：5′-GTTGTTGTTGCATTGGG-3′，5′-AAGATGGAGAGTGGAGCCT-3′。

1.3.3 肝組織學檢查 若有嚴重并發癥無法進行肝穿刺活檢患者，根據影像學及臨床診斷確診，其余患者進行肝穿刺活檢，其中共有156例患者接受組織學檢查。受檢查在B超定位下，采用16G肝穿刺經皮負壓針吸活檢，吸取肝組織，樣本使用10%甲醛固定，石蠟包埋切片，對切片進行HE染色、Masson三色染色，病理診斷結果由3位有經驗的病理醫師閱片。按照《慢性病毒性肝炎臨床與病理的診斷標準》[6]纖維化分期(S)標準將肝纖維化程度分為S0～S4五期，S4級為早期肝硬化或肯定的肝硬化。對于合并嚴重凝血功能異常、大量腹水等無法進行肝穿刺活檢患者，根據影像學及臨床診斷，確診為肝硬化，則作為S4期。

1.4 倫理學審查 本研究經承德醫學院附屬醫院倫理委員會審批，批號：2016HL008。患者均知情同意。

1.5 統計學方法 采用統計學軟件SPSS 22.0進行數據處理分析。計量資料采用表示，兩組間比較采用t檢驗；多組間比較采用方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。計數資料組間比較采用χ2檢驗。等級資料組間比較采用Kruskal-WallisH秩和檢驗。相關性分析采用Pearson相關性分析。采用受試者工作特征曲線(ROC曲線)分析外周血lncRNA-LET對肝硬化的預測價值。P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 一般資料 共納入CHB患者175例，其中男101例、女74例，肝硬化組52例(代償期患者39例、失代償期患者13例)，非肝硬化組123例。3組受試者性別、年齡比較差異均無統計學意義(P值均>0.05)，非肝硬化組患者與肝硬化組患者HBV DNA比較差異亦無統計學意義(P>0.05)，而肝硬化組患者HBeAg陽性及活動性CHB比例均顯著高于非肝硬化組(P值均<0.05)(表1)。

2.2 3組受試者肝功能指標比較 肝硬化患者和非肝硬化患者血清肝功能指標TBil、TBA、Alb以及ALT均顯著高于正常對照組，而血清ChE顯著低于正常對照組(P值均<0.05)；肝硬化患者血清肝功能指標TBil、TBA、Alb以及ALT均顯著高于非肝硬化患者(P值均<0.05)，血清ChE顯著低于非肝硬化患者(P值均<0.05)(表2)。在肝硬化患者中，Chid-Pugh分級A級21例、B級18例、C級13例。

2.3 3組受試者外周血lncRNA-LET水平比較 肝硬化組患者與非肝硬化組患者外周血lncRNA-LET相對表達量顯著低于正常對照組(P值均<0.05)，其中肝硬化組患者外周血lncRNA-LET相對表達量顯著低于非肝硬化患者(P<0.05)(表3)。

2.4 CHB患者不同纖維化分期外周血lncRNA-LET水平比較 根據CHB患者纖維化分期標準，S0期患者16例、S1期患者25例、S2期患者47例、S3期患者35例、S4期患者52例。隨著患者肝纖維化分期的增加，lncRNA-LET相對表達量顯著降低(P值均<0.05)(表4)。

表3 3組受試者外周血lncRNA-LET水平比較

表4 CHB患者不同纖維化分期外周血lncRNA-LET水平比較

2.5 CHB患者外周血lncRNA-LET與肝纖維分期、肝功能的相關性 Pearson相關性分析結果顯示，CHB患者外周血lncRNA-LET相對表達量與肝纖維化分期、TBil、TBA、Alb、ALT呈負相關(r值分別為-0.352、-0.372、-0.364、-0.410，P值均<0.001)，與ChE呈正相關(r=0.340，P<0.001)。

2.6 CHB患者外周血lncRNA-LET對肝硬化的預測價值 ROC曲線分析外周血lncRNA-LET對肝硬化的預測價值，結果顯示，ROC曲線下面積為0.934，最佳截斷值為0.833，敏感度為84.57%，特異度為80.57%(圖1)。

表1 3組受試者一般資料比較

表2 3組受試者肝功能指標比較

3 討論

肝纖維化是多種慢性肝病進展為肝硬化的必經過程，晚期肝纖維化的持續存在常常可導致肝硬化甚至原發性肝癌的發生[6]。目前越來越多的研究認為，肝纖維化甚至早期肝硬化是可逆的[7]，因此對于肝硬化的診斷成為學者關注的重點。肝硬化作為慢性肝炎發生發展的一個重要環節，大部分肝癌的病理生理過程均與肝硬化的演變密切相關。既然肝硬化與肝癌之間的發生發展具有著密切的聯系，那么在肝硬化的早期階段對疾病進行干預，逆轉肝硬化病程的進展，對于阻止肝癌的發生發展成為新的可能[8]。肝硬化的發生及發展作為一個復雜的病理過程，涵蓋了肝細胞的壞死凋亡、間充質細胞的增殖以及細胞外基質的沉積破壞等過程，因此有學者[9-10]提出，可能存在具有差異性表達的lncRNA可通過影響肝細胞凋亡以及間充質細胞增殖等過程從而影響肝硬化疾病進程。

lncRNA是一類長度在200個核苷酸以上的RNA分子，隨著目前新一代高通量測序技術的發展和廣泛應用，在各類生物體中均發生大量具有生物學功能的lncRNA[11]。目前研究[12-13]顯示，lncRNA廣泛參與生物體內多種重要的生理病理過程，可以從觀遺傳水平、轉錄水平以及轉錄后水平等多個方面對靶基因進行調控。在肝硬化不同階段均伴隨著肝臟炎癥損傷、細胞凋亡以及損傷后修復等過程，在不同階段細胞損傷凋亡都有所不同，lncRNA對肝硬化的調控機制，可能與調控肝細胞凋亡、間充質細胞增殖等有關[14]。目前有研究[15]報道顯示，lncRNA-LET在肝癌患者中出現異常表達，而鑒于肝硬化與肝癌之間的密切聯系，筆者推測是否可將lncRNA-LET作為CHB肝硬化的診斷指標，從而為患者診斷及干預提供依據。

本研究結果顯示，肝硬化組與非肝硬化組患者外周血lncRNA-LET相對表達量顯著低于正常對照組(P值均<0.05)；肝硬化組患者外周血lncRNA-LET相對表達量顯著低于非肝硬化患者(P<0.05)。提示在乙型肝炎患者中可出現lncRNA-LET表達量的降低，且肝硬化患者lncRNA-LET表達量更低。有報道[16-17]顯示，在肝癌組織中lncRNA-LET相對表達量較癌旁正常組織顯著降低，本研究進一步證實，在CHB向肝硬化甚至肝癌發展進程中具有差異性表達。針對患者肝纖維化進程進行lncRNA-LET表達水平的比較，結果顯示，隨著患者肝纖維化分期的增加，lncRNA-LET相對表達量顯著降低(P<0.05)，CHB患者外周血lncRNA-LET相對表達量與肝纖維化分期呈顯著負相關關系(r=-0.352，P<0.001)。提示隨著肝纖維化進程的發展，患者外周血lncRNA-LET表達量明顯降低，進一步證實了lncRNA-LET異常表達與患者肝纖維化進程明顯相關。基于上述研究，發現lncRNA-LET與CHB肝硬化的發生發展有關，而是否可以將其作為患者肝硬化的診斷指標之一，研究采用ROC曲線分析其診斷價值，結果顯示，ROC曲線下面積為0.934，最佳截斷值為0.833，提示lncRNA-LET對CHB肝硬化具有良好的診斷價值。但是由于本研究納入樣本量較小，且僅針對患者外周血lncRNA-LET水平與疾病進程進行分析，有關lncRNA-LET對肝硬化的調控機制，仍需要進一步深入研究分析；此外，本研究缺乏lncRNA-LET與其他血清學診斷方式的比較，下一步研究還需與各種常用血清學指標進行對比分析或聯合運用，以更好地指導臨床工作。

綜上所述，外周血lncRNA-LET隨著CHB肝纖維化進程的發展，其表達水平有所降低，且對CHB肝硬化具有較好的診斷價值，可成為肝硬化診斷的潛在生物學指標。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會成員、受試者監護人以及與公開研究成果有關的利益沖突，特此聲明。

作者貢獻聲明：牛興杰、劉志慧、劉耀敏負責課題設計，資料分析，撰寫論文；劉志慧、王艷飛、張國民參與收集數據，修改論文；崔鳳梅、劉金霞等負責擬定寫作思路，指導撰寫文章并最后定稿。