山萘酚對人肝癌Bel-7402細胞增殖、遷移、侵襲及凋亡的影響

仲富瑞, 程宦立, 張 浩, 杜毅超,b, 胡啟輝, 付文廣,b, 夏先明,b

西南醫科大學附屬醫院 a. 肝膽外科； b. 四川省院士(專家)工作站， 四川 瀘州 64600

Effectofkaempferolontheproliferation,migration,invasion,andapoptosisofhumanhepatomaBel-7402cells

ZHONGFuruia,CHENGHuanlia,ZHANGHaoa,DUYichaoa,b,HUQihuia,FUWenguanga,b,XIAXianminga,b.

(a.DepartmentofHepatobiliarySurgery,b.Academician(Expert)WorkstationofSichuanProvince,TheAffiliatedHospitalofSouthwestMedicalUniversity,Luzhou,Sichuan64600,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the effect of kaempferol on the proliferation, migration, invasion, and apoptosis of human hepatoma Bel-7402 cells and related molecular mechanism.MethodsHepatoma Bel-7402 cells cultured in vitro were randomly divided into control group and low-, middle-, and high-concentration experimental groups. The experimental groups were treated with low-, middle-, and high-concentration kaempferol (25, 50, and 100 μmol/L), and the control group was treated with an equal volume of dimethyl sulfoxide. CCK-8 assay was used to observe the effect of kaempferol on the viability of Bel-7402 cells; plate colony formation assay was used to evaluate the effect of kaempferol on cell colony formation ability; wound healing assay and Transwell chamber were used to observe the effect of kaempferol on cell migration and invasion; Western blot was used to measure the expression of apoptosis- and cycle-related proteins. A one-way analysis of variance was used for comparison between multiple groups, and the least significant differencet-test was used for further comparison between two groups.ResultsAfter 24 hours of treatment, the cell viability was 100.00%±2.72% in the control group and 75.70%±2.42%, 62.79%±2.45%, and 43.41%±2.11%, respectively, in the low-, middle-, and high-concentration experimental groups, and compared with the control group, the experimental groups had a significant reduction in cell viability (allP<0.05). The number of cell colonies was 923.3±35.2 in the control group and 682.7±24.4, 464.0±22.0, and 327.3±14.0, respectively, in the low-, middle-, and high-concentration experimental groups, and compared with the control group, the experimental groups had a significant reduction in cell colony formation ability (allP<0.05). After 24 hours of treatment, the relative migration rate was 100.00%±1.11% in the control group and 63.33%±1.16%, 51.72%±3.23%, and 37.18%±2.71%, respectively, in the low-, middle-, and high-concentration experimental groups, and the number of transmembrane cells was 212.0±3.0 in the control group and 134.0±2.0, 71.0±2.0, and 34.0±1.0, respectively, in the low-, middle-, and high-concentration experimental groups; compared with the control group, the experimental groups had significant reductions in relative migration rate and number of transmembrane cells (allP<0.05). After 48 hours of treatment, compared with the control group, the low-, middle-, and high-concentration experimental groups had a significant reduction in the expression of the anti-apoptotic protein Bcl-2 (allP<0.05), a significant increase in the expression of the pro-apoptotic protein Bax (allP<0.05), and a significant reduction in the expression of CyclinD1 (allP<0.05).ConclusionKaempferol can inhibit the proliferation, migration, and invasion of human hepatoma Bel-7402 cells and promote the apoptosis of such cells, possibly by regulating the apoptosis proteins Bax and Bcl-2 and downregulating the expression of CyclinD1.

Keywords：kaempferol; liver neoplasms; cell proliferation; cell movement; apoptosis

原發性肝癌是人類消化系統最常見的癌癥之一[1]，在我國尤為高發,具有惡性程度高、復發率高、轉移率高的特點[2]。隨著手術切除、射頻消融、靶向治療等治療手段不斷發展，肝癌患者的預后得到了一定改善，但治療后的復發率仍較高，整體的5年生存率仍不理想[3]，因此尋找有效地抑制肝癌細胞增殖和轉移的天然藥物，無疑具有重大意義。山萘酚(Kaempferol, KA)是一種從傳統中藥趕黃草中提取的天然黃酮類化合物，現代藥理研究[4]發現KA具有抗氧化、抗炎、抗癌等多種藥理活性，且有研究證明KA能夠通過不同的機制抑制卵巢癌[5]、結直腸癌[6]等癌細胞增殖轉移，促進癌細胞凋亡。但KA在肝癌中的基礎研究較少，故本研究通過體外實驗，探討KA對肝癌Bel-7402細胞體外克隆形成、增殖、侵襲遷移、凋亡的影響，也將闡述可能的分子機制，以期為KA用于新藥開發及肝癌的臨床治療提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料 肝癌Bel-7402細胞為本實驗室保存，高糖DMEM培養基和胎牛血清購自美上海中喬新舟生物科技有限公司，山萘酚、結晶紫購于上海麥克林生化科技有限公司，CCK-8試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒、ECL化學發光試劑盒、一抗Bcl-2、Bax、cyclin D1、GAPDH及二抗均購自上海碧云天生物科技有限公司。

1.2 研究方法

1.2.1 細胞培養 將肝癌Bel-7402細胞置于含10%胎牛血清、1%青鏈霉素的高糖DMEM培養液中放于恒溫培養箱(5%CO2、37 ℃)中常規傳代培養，維持細胞處于對數生長期。

1.2.2 實驗分組 將處于對數生長期的肝癌Bel-7402細胞隨機分為對照組和實驗組，實驗組分別予以含低濃度KA(25 μmol/L)、中濃度KA(50 μmol/L)、高濃度KA (100 μmol/L)的培養液處理，對照組給予含等量二甲基亞砜(DMSO)的培養液處理。

1.2.3 細胞增殖能力的檢測 采用CCK-8試劑盒檢測KA對肝癌Bel-7402細胞增殖的影響。將細胞接種于96孔板中，分組及干預方法同1.2.2，培養24、48、72 h后，在實驗結束前2 h每孔加入CCK-8溶液10 μl培養2 h，再用酶標儀450 nm處測定吸光度(OD)值，計算細胞活力。

1.2.4 細胞克隆形成檢測 取對數生長期的Bel-7402細胞，以約1000個/孔的密度將細胞接種于6孔板中，細胞分組及干預同1.2.2，置于培養箱中連續培養10 d左右，然后以4%多聚甲醛固定20 min，PBS漂洗后結晶紫染色15 min，雙蒸水漂洗后置于空氣中干燥，最后拍照計數。

1.2.5 細胞遷移能力的檢測 采用劃痕試驗檢測KA對Bel-7402肝癌細胞的遷移能力的影響。取對數生長期細胞配制成細胞懸液,鋪于6孔板中培養，待細胞基本長滿后，在每孔底部劃出3條均勻豎線，PBS洗滌2次后于倒置顯微鏡下觀察作為0時狀態，并標記每個觀察點，再更換為含不同濃度KA(0、25、50、100 μmol/L)的完全培養基繼續培養，于不同時間(24、48 h)在倒置顯微鏡下拍照，記錄同一個觀察點劃痕寬度的變化，計算各組細胞的相對遷移率。

1.2.6 Transwell小室侵襲實驗 采用Transwell小室檢測KA對腫瘤細胞侵襲能力的影響。無菌條件下Matrigel(基質膠)于冰浴融化，用DMEM培養液稀釋成1 g/L，取50 μl鋪于Transwell上室，Transwell下室每孔加入600 μl含10%胎牛血清的DMEM培養基，上室加入Bel-7402肝癌細胞，調整細胞濃度為4×105/ml，每孔50 μl，設KA低、中、高濃度實驗組及對照組，分組后加入不同濃度的KA(25、50、100 μmol/L)及溶媒DMSO對上室細胞進行干預。培養24 h后，去除上室中培養液，用棉簽輕輕擦去上層中的細胞，4%多聚甲醛中固定20 min，PBS洗滌2次，結晶紫染色15 min，再用PBS洗滌，在倒置顯微鏡下拍照計數穿過小室的細胞。

1.2.7 Western Blot法檢測Bcl-2、Bax、CyclinD1及GADPH蛋白表達水平 取對數生長期的Bel-7402細胞接種于6孔板，置于細胞培養箱中培養24 h后，更換為含有不同濃度KA(0、25、50、100 μmol/L)的完全培養基，48 h后收集細胞并將各組細胞裂解，按照蛋白提取試劑盒說明書提取蛋白，使用BCA法測量蛋白濃度并定量。將定量后的各實驗組和對照組分別取等量總蛋白上樣，進行SDS-PAGE凝膠電泳分離并轉至PVDF膜上，將膜置于用PBST配制的含5%脫脂奶粉的蛋白封閉液中封閉2 h，一抗孵育過夜(4 ℃)。次日PBST避光漂洗3次后二抗室溫孵育1.5 h，PBST漂洗3次，最后使用ECL化學發光試劑盒進行曝光，凝膠成像系統分析。

2 結果

2.1 KA對肝癌Bel-7402細胞增殖的影響 各組處理Bel-7402細胞24、48、72 h后，Bel-7402細胞的對照組和低、中、高濃度組在各時間點的細胞活力為24 h：(100.00±2.72)%、(75.70±2.42)%、(62.79±2.45)%、(43.41±2.11)%; 48 h：(100.00±2.81)%、(71.19±3.13)%、(53.53±3.44)%、(39.44±3.60)%; 72 h: (100.00±4.06)%、(72.65±3.32)%、(52.42±1.70)%、(34.12±1.41)%。結果顯示，相比于對照組，3個時間點的各實驗組Bel-7402細胞的相對活力均明顯下降(P值均<0.05)(圖1)。

2.2 KA對肝癌Bel-7402細胞克隆形成的影響 對照組和低、中、高濃度組Bel-7402細胞的細胞克隆形成數分別為：923.3±35.2、682.7±24.4、464.0±22.0、327.3±14.0。相比于對照組，各實驗組Bel-7402細胞的克隆形成數目呈劑量依賴性減少(P值均<0.05)(圖 2)。

2.3 KA對肝癌Bel-7402細胞遷移能力的影響 對照組和低、中、高濃度組Bel-7402細胞的相對遷移率在24 h為：(100.00±1.11)%、(63.33±1.16)%、(51.72±3.23)%、(37.18±2.71)%；48 h為：(100.00±2.90)%、(58.12±2.80)%、(36.81±3.19)%、(36.39±3.30)%。結果顯示，相對于對照組，各實驗組在24 h和48 hBel-7402細胞的遷移能力均顯著下降(P值均<0.05)(圖3)。

2.4 KA對肝癌Bel-7402細胞侵襲能力的影響 各組處理細胞24 h后，對照組和低、中、高濃度組穿過Transwell小室的Bel-7402細胞數目分別為212.0±3.0、134.0±2.0、71.0±2.0、34.0±1.0。結果顯示，與對照組相比，各實驗組穿過Transwell小室的細胞數目明顯減少(P值均<0.05)(圖4)。

2.5 KA對肝癌Bel-7402細胞凋亡及細胞周期相關蛋白表達的影響 各組處理細胞48 h后，Western Blot結果顯示，與對照組相比，各實驗組下調了Bel-7402細胞中抗凋亡Bcl-2蛋白的表達(P值均<0.05)，上調了Bel-7402細胞中促凋亡蛋白Bax的表達(P值均<0.05)，且下調了Bel-7402細胞中周期相關蛋白Cyclin D1的表達(P值均<0.05)(圖5，表1)。

表1 各組Bel-7402細胞相關蛋白相對表達水平的比較

3 討論

肝癌是全世界最常見的侵襲性癌癥之一[7]，大多數肝癌患者早期癥狀不明顯，確診時已是晚期，已不再適合采用手術切除方式治療[8]。由于肝癌內在的藥物代謝活性，使其對化療存在一定的抵抗性[9]，且常規化療藥物長期使用會產生不良反應和耐藥性，也限制了其在臨床上的應用。KA因其抗炎、抗氧化等優點，在世界范圍內受到越來越多的關注，有研究[10]表明山萘酚通過下調microRNA-21的表達，從而抑制肝癌HepG2細胞的增殖、遷移和侵襲，還有研究[11]顯示KA通過AMPK及AKT途徑誘導自噬，對肝癌SK-HEP-1細胞產生抗增殖作用。但肝癌由于致病因素多變導致了不同患者間的異質性[12]，在肝癌的進展過程中體內微環境的變化會進一步促進其體內肝癌細胞發生變異，產生更多細胞克隆亞型[13]，從而導致肝癌的高度異質性，而高度異質性是肝癌難以治療的主要原因之一，所以同一藥物對不同的肝癌細胞發揮的效應及分子機制也不盡相同。KA對肝癌細胞的研究限于肝癌 HepG2和SK-HEP-1細胞等，且兩者抗癌效應的相關機制不一，故有關KA對于肝癌細胞的作用有必要進一步探究。目前KA對肝癌Bel-7402細胞的影響及其可能機制未見相關報道。

本實驗用梯度濃度的KA分別處理肝癌Bel-7402細胞，與對照組進行比較，發現經KA干預后的Bel-7402細胞，其細胞活力、遷移及侵襲能力均受到明顯抑制。細胞凋亡是一種嚴格受基因調控的程序性死亡方式[14-15]，癌細胞通過多種方式異常激活抗凋亡蛋白的活性和抑制促凋亡蛋白活性[16]，從而逃避凋亡，該過程的異常與腫瘤的發生、發展密切相關。細胞增殖的基礎是細胞周期的有序進行，癌癥的難治愈性正是因異常的癌細胞周期而導致其無限增殖[17]，因此研究細胞凋亡與細胞周期的調控因子是癌癥研究的重點，故本實驗通過檢測細胞凋亡與細胞周期相關蛋白的表達水平來探究KA的抗癌效應。

Bax是一種促凋亡因子,而Bcl-2是抗凋亡因子，同屬Bcl-2基因家族, Bcl-2家族是細胞凋亡的主要調控因素[18]。本研究結果顯示，與對照組相比，不同濃度KA處理Bel-7402細胞后，出現Bcl-2表達明顯下調和Bax表達明顯上調的現象，提示KA可能通過抑制Bcl-2的表達和促進Bax表達來誘導腫瘤細胞發生凋亡。CyclinD1是G1期細胞周期蛋白，在多種腫瘤中都有CylinD1的高表達。CyclinD1使下游的Rb蛋白磷酸化，從而釋放出轉錄因子E2F，使細胞從G1期進入S期從而促進細胞分裂增殖[19]。在本研究中，與對照組相比，不同濃度KA處理Bel-7402細胞后，CyclinD1蛋白的表達均明顯下調，提示KA可能通過抑制CyclinD1因子的表達使Bel-7402細胞阻滯于G1期, 從而抑制肝癌Bel-7402細胞的快速增殖。

綜上所述，本研究表明KA能顯著抑制Bel-7402細胞增殖、遷移和侵襲。同時，各實驗組均明顯上調Bax、下調Bcl-2和CyclinD1的表達水平，表明KA可有效誘導肝癌Bel-7402細胞凋亡與抑制其增殖，其作用機制可能與調控凋亡蛋白Bax/Bcl-2以及周期蛋白CyclinD1的表達有關。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者以及與公開研究成果有關的利益沖突，特此聲明。

作者貢獻聲明：仲富瑞、杜毅超、付文廣負責課題設計，資料分析，撰寫論文；程宦立、張浩、胡啟輝參與收集數據，修改論文；夏先明等負責擬定寫作思路，指導撰寫文章并最后定稿。