三氧化二砷載藥微球治療VX2肝腫瘤兔模型的效果分析

王文輝, 段旭華, 李 浩, 李鳳堯, 琚書光, 王滿周, 任建莊, 韓新巍

鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院 介入科， 鄭州 450052

大多數(shù)肝臟惡性腫瘤患者確診時(shí)已處于中晚期，受腫瘤體積、數(shù)目、轉(zhuǎn)移等限制已不適合行外科手術(shù)切除，傳統(tǒng)的經(jīng)肝動(dòng)脈化療栓塞術(shù)(cTACE)目前被公認(rèn)為是肝癌非手術(shù)治療的首選方式[1]。載藥微球作為一種新型的栓塞材料，可以通過(guò)電荷吸附作用將化療藥物吸附到微球內(nèi)部。前期研究[2]顯示，CalliSpheres載藥微球(100～300 μm)對(duì)三氧化二砷(arsenic trioxide，ATO)的最佳載藥時(shí)間為40 min，將規(guī)格為1 g×1瓶、粒徑為100～300 μm的載藥微球與60 mg (10 mg/ml，6 ml)的ATO混合均勻40 min后，可檢測(cè)其內(nèi)能荷載ATO量為13.8±1.49 mg，載藥量達(dá)到臨床所需。載藥栓塞微球(callispheres beads，CB)不僅達(dá)到局部化療和栓塞腫瘤供血?jiǎng)用}的雙重目的，另外微球緩慢釋放抗腫瘤藥物能力對(duì)腫瘤持續(xù)性殺傷，還可以提高治療指數(shù)以及藥物的選擇性[3]。對(duì)于不可切除的肝癌，TACE術(shù)中使用載藥栓塞微球與cTACE相比有著更好地臨床療效和安全性，并且可減少介入治療的次數(shù)，進(jìn)而可以改善生活質(zhì)量[4]。在活性瘤組織中，CB加載ATO(CBATO)中的ATO濃度在3 d內(nèi)逐漸上升，并在3 d時(shí)達(dá)到頂峰后下降。由此得知，載藥微球攜載的ATO可較長(zhǎng)時(shí)間持續(xù)的作用于局部腫瘤組織，從而起到持續(xù)抑制腫瘤的目地, 確保ATO劑量依賴和時(shí)間依賴效用的安全發(fā)揮[5]。本研究從腫瘤細(xì)胞的凋亡與增殖、腫瘤壞死體積、生存期等方面對(duì)TACE應(yīng)用CBATO治療兔VX2肝腫瘤療效進(jìn)行分析。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與動(dòng)物模型 日本大耳白兔[使用許可證編號(hào)：SYXK(豫)2016-0002，生產(chǎn)許可證編號(hào)：SCXK(鄂)2016-0011]130只，體質(zhì)量2.3～2.9 kg，雌雄不限。采用Duan等[6]報(bào)道的方法建立兔VX2肝癌模型(荷瘤種兔為華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心惠贈(zèng))。兔腫瘤模型建模后14 d行增強(qiáng)CT觀察腫瘤是否形成及大小。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組與處理 共有126只實(shí)驗(yàn)兔成功建立VX2肝腫瘤模型，其中有2只死于麻醉，1只死于術(shù)中，有實(shí)驗(yàn)兔均能耐受TACE手術(shù)。采用隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為4組(每組需保證實(shí)驗(yàn)兔30只)，分別為對(duì)照組(術(shù)中注入生理鹽水10 ml)、CB組(術(shù)中注入空白微球，微球直徑100～300 μm，0.1 g,江蘇恒瑞)、CBATO組(術(shù)中注入ATO載藥微球，微球直徑100～300 μm，江蘇恒瑞，ATO用量0.5 mg/kg)；cTACE組(術(shù)中注入ATO超液態(tài)碘油乳化劑，ATO用量0.5 mg/kg)。采用Duan等[7]的方法制備CBATO。各實(shí)驗(yàn)組在12 h、3 d、7 d、14 d各處死5只實(shí)驗(yàn)兔取殘瘤區(qū)組織進(jìn)行HE染色及免疫組化等檢測(cè)，剩余10只實(shí)驗(yàn)兔觀察生存期。

1.3 兔VX2肝腫瘤TACE手術(shù)方法 實(shí)驗(yàn)兔術(shù)前禁飲食24 h，于左側(cè)臀肌肌注0.2～0.3 ml/kg的速眠新Ⅱ注射液(敦化市圣達(dá)動(dòng)物藥品有限公司)麻醉實(shí)驗(yàn)兔，并將其仰臥位固定于實(shí)驗(yàn)臺(tái)。兔右側(cè)股動(dòng)脈根部皮膚常規(guī)脫毛消毒，切開皮膚分離暴露股動(dòng)脈，在減影血管造影 (Siemens Artis zeego, 德國(guó))導(dǎo)向下將4.0F Cobra導(dǎo)管(Terumo, 日本)插至腹腔干，行腹腔干及肝固有動(dòng)脈造影，明確腫瘤供血?jiǎng)用}及血供情況。再引入1.9F微導(dǎo)管(EcheconTM-14,EV3,美國(guó))超選至腫瘤供血?jiǎng)用}。按照上述各治療組治療方法進(jìn)行栓塞，栓塞終點(diǎn)為造影無(wú)腫瘤染色或門靜脈小分支內(nèi)可見碘油沉積，若仍有腫瘤染色，給予8Spheres微球栓塞(100～300 μm，江蘇恒瑞)。

1.4 組織標(biāo)本收集 打開各組處死實(shí)驗(yàn)兔的腹腔，取出肝臟組織留取圖像，并取肝臟殘瘤區(qū)組織置于4%多聚甲醛中固定，石蠟包埋后以4 μm厚切片，常規(guī)HE染色觀察病理學(xué)改變。

1.5 腫瘤相關(guān)指標(biāo)觀察

1.5.1 腫瘤壞死體積、腫瘤生長(zhǎng)率和腫瘤壞死率 術(shù)后7 d沿各組處死實(shí)驗(yàn)兔原發(fā)病灶長(zhǎng)軸切開腫瘤組織，測(cè)量瘤體最大長(zhǎng)徑(a)和短徑(b)，按V=(1/2)ab2計(jì)算腫瘤總體積(CV)。分別測(cè)量各組瘤體切面壞死區(qū)長(zhǎng)徑(c)和短徑(d)。計(jì)算術(shù)后7 d腫瘤生長(zhǎng)率、腫瘤壞死率。腫瘤生長(zhǎng)率=術(shù)后腫瘤體積/術(shù)前腫瘤體積×100%，腫瘤壞死率=壞死面積/腫瘤面積×100%。

1.5.2 腫瘤細(xì)胞凋亡百分比和增殖指數(shù) 每個(gè)樣品取5個(gè)區(qū)域，采用TUNEL-DAPI雙染色法(Roche，德國(guó))檢測(cè)腫瘤細(xì)胞的凋亡。通過(guò)計(jì)算每個(gè)高倍鏡視野(×200)的凋亡陽(yáng)性細(xì)胞陽(yáng)性百分率，對(duì)結(jié)果進(jìn)行半定量分析。增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)檢測(cè)腫瘤細(xì)胞增殖活性。采用免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)殘瘤區(qū)PCNA表達(dá)，計(jì)數(shù)每張切片中5個(gè)高倍鏡視野(×200)內(nèi)200個(gè)細(xì)胞中PCNA陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，PCNA陽(yáng)性細(xì)胞表現(xiàn)為細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒沉積，計(jì)算增殖指數(shù)(proliferation index,PI)，其中PCNA陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比即為PI。

1.6 倫理學(xué)審查 本實(shí)驗(yàn)經(jīng)過(guò)河南省動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，批號(hào)：科研-2017-03，符合實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物管理與使用準(zhǔn)則。

2 結(jié)果

2.1 CBATO組兔VX2肝腫瘤建模過(guò)程 兔肝臟VX2腫瘤植入14 d增強(qiáng)CT動(dòng)脈期可見強(qiáng)化灶(圖1a)； 肝動(dòng)脈造影實(shí)質(zhì)期顯示肝左外葉內(nèi)占位性病變(圖1b)；注入CBATO栓塞后造影顯示原占位性病變無(wú)腫瘤供血，栓塞徹底(圖1c)；術(shù)后7 d，可見栓塞后的腫瘤組織(圖1d)；沿腫瘤直徑最大徑線切開腫瘤組織，可見腫瘤組織壞死徹底(圖1e)。

2.2 術(shù)后各組HE染色 術(shù)后7 d，在CBAT0組中可見單個(gè)栓塞微球在腫瘤細(xì)小血管內(nèi)(圖2)。對(duì)照組中HE染色可見明顯的腫瘤組織，cTACE組和CB組HE染色中可見腫瘤組織，少于對(duì)照組。

2.3 腫瘤壞死體積、腫瘤生長(zhǎng)率、腫瘤壞死率的比較 荷瘤兔腫瘤大小為11.52～16.80 mm，平均(12.58±3.50) mm，各組間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均>0.05)。術(shù)后7 d，CBATO組、CB組、cTACE組及對(duì)照組殘瘤與壞死區(qū)總體積分別為(1.61±0.35)cm3、(3.03±0.51)cm3、(2.65±0.53)cm3及(3.93±0.66)cm3，CBATO組與cTACE組、CB組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值分別為0.009、0.016)；cTACE組與CB組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.347)。術(shù)后7 d，CBATO組的腫瘤生長(zhǎng)率明顯低于其他3組(P值均<0.05)，而腫瘤壞死率顯著高于其他3組(P均<0.05)(表1)。

表1 術(shù)后7 d不同組腫瘤生長(zhǎng)率和腫瘤壞死率比較

2.4 腫瘤細(xì)胞PI、凋亡細(xì)胞百分比比較 術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)各組腫瘤細(xì)胞PI和凋亡百分比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)(表2、3)；每組在不同時(shí)間點(diǎn)腫瘤細(xì)胞PI差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均>0.05)，CBATO組、cTACE組和CB組在不同時(shí)間點(diǎn)腫瘤細(xì)胞凋亡百分比比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F值分別為18.759、17.250、27.572，P值均>0.05)；術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)，CBATO組殘留細(xì)胞PI和凋亡百分比與其他3組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)。各組典型腫瘤細(xì)胞增殖染色和凋亡染色見圖3、4。

2.5 生存期的比較 CBATO組、CB組、cTACE組及對(duì)照組中位生存時(shí)間分別為26、18.5、22、15.5 d，術(shù)后35 d實(shí)驗(yàn)兔均死亡。CBATO組生存時(shí)間與cTACE組、CB組及對(duì)照組相比明顯延長(zhǎng)(χ2值分別為3.95、8.99、13.47,P值分別為0.049、0.003、<0.01)。CB組與cTACE組較對(duì)照組生存時(shí)間延長(zhǎng)，但兩組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.137)(圖5)。

表2 術(shù)后各組殘瘤細(xì)胞PI的比較

表3 術(shù)后各組瘤細(xì)胞凋亡百分比比較

3 討論

cTACE作為首先出現(xiàn)的肝癌介入治療方式，療效確切。但也存在以下不足：碘油的乳化劑中化療藥物濃度無(wú)法在受控的情況下持續(xù)釋放藥物；因不能徹底栓塞腫瘤，需多次栓塞，隨著治療次數(shù)增多不僅增加了患者的治療費(fèi)用和心理負(fù)擔(dān)，而且會(huì)加重患者的肝硬化和肝損傷[8]。cTACE多采用碘化油作為栓塞材料栓塞腫瘤血管，但術(shù)后患者病灶內(nèi)碘化油會(huì)大量缺失，造成這種情況的原因可能是碘化油栓塞不徹底，受腫瘤組織周圍側(cè)支循環(huán)沖刷所致，這樣不僅會(huì)導(dǎo)致腫瘤療效下降，還可能導(dǎo)致碘化油擴(kuò)散到其他組織，引發(fā)患者多種不良反應(yīng)[9]。載藥栓塞微球是在cTACE基礎(chǔ)上的一項(xiàng)嘗試和創(chuàng)新，其用于原發(fā)性肝癌及轉(zhuǎn)移性肝癌的治療，已取得良好的療效[10]。

載藥微球被作為TACE術(shù)中化療藥物進(jìn)入病灶的載體，因其可在腫瘤內(nèi)持續(xù)緩慢釋放化療藥物而被廣泛使用。李浩等[5]研究證明了載藥微球與碘油相比，可以在腫瘤組織中持續(xù)緩慢釋放化療藥物，較長(zhǎng)時(shí)間維持腫瘤組織內(nèi)較高濃度的化療藥物，且不會(huì)增加實(shí)驗(yàn)兔的肝腎毒性。相比較碘油，載藥微球不僅可以更徹底的栓塞腫瘤血管，并且緩釋的化療藥物也可以持續(xù)作用于腫瘤組織且較少藥物進(jìn)入全身循環(huán)系統(tǒng)，而使腫瘤組織更徹底的壞死[11]。與cTACE 相比，TACE術(shù)中使用載藥栓塞微球的安全性、有效性更為理想，Duan等[12]研究證明了TACE術(shù)中應(yīng)用CBATO 治療原發(fā)性肝癌安全有效、近期臨床療效好。

Liu等[13]在cTACE術(shù)中采用20 mg ATO與碘油混合治療原發(fā)性肝癌，證實(shí)其具有更好的安全性、有效性以及不良反應(yīng)小等優(yōu)點(diǎn)。ATO能夠抑制細(xì)胞凋亡調(diào)控基因Bcl-2的表達(dá)，進(jìn)而控制肝癌細(xì)胞的增生和繁殖，促使腫瘤細(xì)胞的周期阻滯、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的分化、抑制腫瘤內(nèi)血管的形成[14]。ATO被認(rèn)為通過(guò)抑制基質(zhì)金屬蛋白酶9表達(dá)，從而抑制腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移[15]。ATO通過(guò)下調(diào)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的表達(dá)抑制腫瘤血管的形成、肝癌的生長(zhǎng)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[16]。TACE術(shù)后肝癌殘余組織內(nèi)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子表達(dá)增強(qiáng)，微血管密度增高，預(yù)示腫瘤新生血管增生[17]。CBATO緩慢持久的釋放化療藥物，可與栓塞創(chuàng)造的缺血缺氧環(huán)境結(jié)合，更好地發(fā)揮抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡及抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的能力。因此本實(shí)驗(yàn)中CBATO組取得更長(zhǎng)的中位生存期。本研究發(fā)現(xiàn)CBATO組腫瘤細(xì)胞凋亡程度明顯高于cTACE組，而腫瘤細(xì)胞增殖則明顯減少，證實(shí)了腫瘤內(nèi)持續(xù)高濃度的ATO和栓塞后缺血、缺氧環(huán)境協(xié)同控制腫瘤效果更好。

本研究通過(guò)對(duì)各實(shí)驗(yàn)組腫瘤栓塞的治療效果、腫瘤細(xì)胞的增殖和凋亡、腫瘤生長(zhǎng)率和壞死率以及腫瘤生長(zhǎng)等方面進(jìn)行評(píng)估，發(fā)現(xiàn)TACE術(shù)中應(yīng)用空白微球和ATO碘油乳化液雖能夠起到一定的栓塞效果，促使腫瘤細(xì)胞凋亡，而應(yīng)用CBATO能夠更加有效提高腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤細(xì)胞增殖。因空白微球、ATO碘油乳化液在藥物的釋放和肝動(dòng)脈栓塞上均有欠佳的表現(xiàn)，對(duì)比得出CBATO在肝癌治療的方面具有更好的療效。

綜上所述，TACE術(shù)中應(yīng)用CBATO可明顯提高兔肝VX2肝腫瘤的壞死率，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡，抑制腫瘤細(xì)胞增殖并延長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的生存期。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會(huì)成員、受試者監(jiān)護(hù)人以及與公開研究成果有關(guān)的利益沖突，特此聲明。

作者貢獻(xiàn)聲明：王文輝負(fù)責(zé)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，標(biāo)本檢測(cè)，收集數(shù)據(jù)，資料分析，撰寫論文；李浩、李鳳堯、琚書光參與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，收集數(shù)據(jù)；王滿周參與標(biāo)本檢測(cè)；段旭華、任建莊、韓新巍負(fù)責(zé)擬定課題設(shè)計(jì)，寫作思路，指導(dǎo)撰寫文章并最后定稿。