lncRNA LUCAT1對(duì)膀胱癌細(xì)胞增殖、凋亡的影響及其機(jī)制研究

王輝，田偉，楊建兵，李占琦，高衛(wèi)軍

陜西省核工業(yè)二一五醫(yī)院泌尿外科1、病理科2，陜西 咸陽(yáng) 712000

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，傳統(tǒng)的手術(shù)、化療治療手段雖有一定療效，但仍存在不良反應(yīng)大、部分患者無(wú)法耐受、腫瘤復(fù)發(fā)率和進(jìn)展率較高等缺點(diǎn)[1]。近年來，靶向治療成為新的治療方法，相較于傳統(tǒng)化療，其不僅提高了療效，還具有明顯優(yōu)勢(shì)[2]。研究發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)鏈非編碼RNA(LncRNA)可通過影響腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展，異常表達(dá)的LncRNA 與膀胱癌的發(fā)生發(fā)展也密切相關(guān)[3]。作為非編碼RNA大家族的miRNA，其同樣也與膀胱癌的進(jìn)展密切相關(guān)，可作為診斷和治療膀胱癌的新靶點(diǎn)[4]。研究發(fā)現(xiàn)LUCAT1在非小細(xì)胞肺癌中上調(diào)表達(dá)，敲低LUCAT1 可抑制細(xì)胞增殖[5]；LUCAT1 通過 miR-200c/ABCB1調(diào)節(jié)骨肉瘤中的甲氨蝶呤抗性[6]；上調(diào)lncRNA LUCAT1 能通過調(diào)控miR-181a 的表達(dá)促進(jìn)宮頸癌的增殖，遷移和侵襲[7]。miR-493-5p 在前列腺癌中表達(dá)下調(diào)，過表達(dá)miR-493-5p 可抑制前列腺癌細(xì)胞的增殖、上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)和遷移侵襲[8]；miR-493-5p通過靶向VAMP2抑制肝癌細(xì)胞的增殖和侵襲，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡[9]。而LUCAT1和miR-493-5p對(duì)膀胱癌的發(fā)生發(fā)展的影響及其在膀胱癌中的作用機(jī)制尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)旨在研究LUCAT1 和miR-493-5p 對(duì)膀胱癌增殖和凋亡的影響及LUCAT1是否通過靶向調(diào)節(jié)miR-493-5p影響其下游的基因進(jìn)而影響膀胱癌的進(jìn)展。

1 材料與方法

1.1 材料 膀胱癌細(xì)胞J82、5637、BIU-87 和人正常膀胱上皮細(xì)胞SV-HUC-1均購(gòu)自上海冠導(dǎo)生物工程有限公司；胎牛血清、RPMI-1640 培養(yǎng)基購(gòu)自上海恒渡生物科技有限公司；Trizol試劑、熒光定量PCR試劑盒購(gòu)自上海優(yōu)寧維生物科技股份有限公司；BCA試劑盒購(gòu)自上海榕柏生物技術(shù)有限公司；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海群己生物科技有限公司；MTT試劑盒購(gòu)自上海圻明生物科技有限公司；Annexin V-FITC/PI試劑盒購(gòu)自上海信帆生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 膀胱癌細(xì)胞J82、5637、BIU-87和人正常膀胱上皮細(xì)胞SV-HUC-1 在RPMI-1640 培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)中培養(yǎng)，每天換液一次，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染與分組 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期膀胱癌細(xì)胞5637，無(wú)血清培養(yǎng)12 h 后轉(zhuǎn)染；將si-NC、si-LUCAT1、pcDNA-NC 和 pcDNA-LUCAT1 分別轉(zhuǎn)染至膀胱癌細(xì)胞 5637 中，記為 si-NC 組、si-LUCAT1 組、pcDNA-NC 組和pcDNA-LUCAT1 組；未進(jìn)行任何處理的正常膀胱癌細(xì)胞5637 做為空白對(duì)照組(Control)；將si-LUCAT1 分別與 anti-miR-NC 和 anti-miR-493-5p 共同轉(zhuǎn)染至膀胱癌細(xì)胞5637 中，記為si-LUCAT1+anti-miR-NC 組和 si-LUCAT1+anti-miR-493-5p 組，轉(zhuǎn)染均按照LipofectamineTM2000試劑盒進(jìn)行操作。

1.2.3 qRT-PCR 檢 測(cè) miR-493-5p 和 LUCAT1 表達(dá)水平 收集細(xì)胞提取總RNA，合成cDNA，按試劑盒說明進(jìn)行PCR，以β-actin為內(nèi)參，相對(duì)表達(dá)量用2-△△Ct法計(jì)算。

1.2.4 Western blot 檢測(cè)蛋白表達(dá) 收集細(xì)胞提取總蛋白，BCA 法定量。經(jīng)SDS-PAGE、轉(zhuǎn)膜、封閉，加入一抗(1：1 000)4℃孵育過夜，加入二抗(1：2 000)室溫孵育2 h，顯影、定影、成像，檢測(cè)蛋白條帶吸光度，以目的條帶和β-actin條帶的比值作為蛋白表達(dá)水平。

1.2.5 MTT檢測(cè)細(xì)胞活性 收集培養(yǎng)24 h、48 h、72 h的細(xì)胞，按試劑盒說明進(jìn)行操作，酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm處吸光度(OD)值。細(xì)胞增殖活力(%)=實(shí)驗(yàn)組OD 值/空白對(duì)照組OD值×100%。

1.2.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 收集細(xì)胞，漂洗后按試劑盒說明書，先后加入Annexin V-FITC和PI避光孵育15 min；上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.2.7 熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)檢測(cè)LUCAT1 對(duì)miR-493-5p的靶向調(diào)控 構(gòu)建有miR-493-5p結(jié)合位點(diǎn)的LUCAT1 野生型和突變型熒光素酶表達(dá)載體(LUCAT1-WT 和 LUCAT1-MT)，將其分別與 miR-NC和miR-493-5p 共轉(zhuǎn)染至細(xì)胞；按說明書要求檢測(cè)熒光素酶活性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS20.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件-分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料符合正態(tài)分布，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，組間兩兩比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LUCAT1 和miR-493-5p 在膀胱癌細(xì)胞株和正常膀胱上皮細(xì)胞中的表達(dá)水平 與正常膀胱上皮細(xì)胞SV-HUC-1 相比，膀胱癌細(xì)胞J82、5637、BIU-87中LUCAT1 mRNA的表達(dá)水平明顯升高，miR-493-5p的表達(dá)水平明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見圖1。選擇表達(dá)變化最明顯的5637 細(xì)胞用做后續(xù)試驗(yàn)。

圖1 LUCAT1和miR-493-5p在膀胱癌細(xì)胞株中的表達(dá)水平

2.2 沉默LUCAT1 對(duì)膀胱癌細(xì)胞5637 增殖和凋亡的影響 與si-NC 組相比，si-LUCAT1 組膀胱癌細(xì)胞5637中LUCAT1 mRNA的表達(dá)水平顯著降低，細(xì)胞活性明顯降低，凋亡率明顯升高，CyclinD1 表達(dá)水平明顯降低，Caspase-3 表達(dá)水平明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見圖2。

2.3 LUCAT1 和miR-493-5p 間的相互調(diào)控關(guān)系 TargetScan 預(yù)測(cè)顯示 LUCAT1 與 miR-493-5p 存在結(jié)合位點(diǎn)(圖3A)。熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果(圖3B)顯示，相較于miR-NC組，miR-493-5p組LUCAT1-WT膀胱癌細(xì)胞5637的熒光素酶活性明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，而 LUCAT1-MT 膀胱癌細(xì)胞 5637的熒光素酶活性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。相較于pcDNA-NC 組，pcDNA-LUCAT1 組膀胱癌細(xì)胞 5637中miR-493-5p 的表達(dá)水平明顯降低；相較于si-NC組，si-LUCAT1 組膀胱癌細(xì)胞 5637 中 miR-493-5p 的表達(dá)水平明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見圖3C。

圖3 LUCAT1和miR-493-5p間的調(diào)控關(guān)系

2.4 抑制miR-493-5p表達(dá)逆轉(zhuǎn)沉默LUCAT1對(duì)膀胱癌細(xì)胞5637增殖和凋亡的影響 與si-LUCAT1+anti-miR-NC 組相比，si-LUCAT1+anti-miR-493-5p 組膀胱癌細(xì)胞5637細(xì)胞活性明顯升高，細(xì)胞凋亡率明顯降低，Cyclin D1蛋白的表達(dá)水平明顯升高，Caspase-3蛋白的表達(dá)水平明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見圖4。

2.5 抑制miR-493-5p表達(dá)逆轉(zhuǎn)沉默LUCAT1對(duì)JAK/STAT 信號(hào)通路的影響 與si-NC 組相比，si-LUCAT1 組膀胱癌細(xì)胞 5637 中 p-JAK2、p-STAT 蛋白的表達(dá)水平明顯降低，與si-LUCAT1+anti-miR-NC組相比，si-LUCAT1+anti-miR-493-5p 組膀胱癌細(xì)胞p-JAK2、p-STAT 蛋白的表達(dá)水平明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見圖5。

圖4 抑制miR-493-5p表達(dá)逆轉(zhuǎn)沉默LUCAT1對(duì)膀胱癌細(xì)胞5637增殖和凋亡的影響

圖5 抑制miR-493-5p表達(dá)逆轉(zhuǎn)沉默LUCAT1對(duì)JAK/STAT信號(hào)通路的影響

3 討論

膀胱癌是我國(guó)發(fā)病率和死亡率最高的泌尿生殖系統(tǒng)腫瘤，嚴(yán)重威脅著人們的健康；靶向治療作為一種新的治療模式，有望應(yīng)用在膀胱癌的治療中[10]。近年來研究發(fā)現(xiàn)lncRNA在膀胱癌的發(fā)生發(fā)展中扮演重要角色，lncRNA LUCAT1 是一種不良的預(yù)后因子，可在體外和體內(nèi)促進(jìn)腎癌細(xì)胞增殖[11]；lncRNA LUCAT1還能促進(jìn)胃癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力[12]。LUCAT1在透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌中上調(diào)表達(dá)，并且與其不良預(yù)后顯著相關(guān)；LUCAT1通過AKT/GSK-3β信號(hào)傳導(dǎo)途徑促進(jìn)透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌的增殖和侵襲[13]。此外，LUCAT1 在食管鱗狀細(xì)胞癌中也上調(diào)表達(dá)，LUCAT1 敲低可減少KYSE-30細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[14]。敲除lncRNA LUCAT1 通過調(diào)節(jié)miR-375 能抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的活力和侵襲[15]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，lncRNA LUCAT1 在膀胱癌細(xì)胞中同樣高表達(dá)，沉默LUCAT1 可抑制膀胱癌5637細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

lncRNA和miRNA兩者一般通過相互作用參與表觀遺傳、轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，進(jìn)而參與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展[16]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)LUCAT1靶向負(fù)調(diào)控miR-493-5p的表達(dá)。研究報(bào)道m(xù)iR-493-5p 高表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌的臨床預(yù)后呈正相關(guān)[17]。miR-493-5p通過靶向FUT4可減弱人乳腺癌的侵襲性和致瘤性[18]；miR-493-5p可通過AKT/GSK-3β/Snail信號(hào)傳導(dǎo)抑制前列腺癌的上皮-間質(zhì)化[19]。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-493-5p在膀胱癌細(xì)胞中低表達(dá)；且抑制miR-493-5p 表達(dá)能逆轉(zhuǎn)沉默LUCAT1 對(duì)膀胱癌細(xì)胞5637 的增殖抑制和凋亡促進(jìn)的作用，還逆轉(zhuǎn)了沉默LUCAT1對(duì)JAK2/STAT信號(hào)通路的抑制作用。

STAT3 是細(xì)胞內(nèi)重要的轉(zhuǎn)錄因子，JAK 磷酸化能激活STAT3，JAK/STAT 信號(hào)通路在腫瘤的發(fā)生發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移起著關(guān)鍵作用，JAK2/STAT3是其中重要的一個(gè)重要信號(hào)通路，阻斷該信號(hào)通路可以抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和誘導(dǎo)凋亡[20]。研究發(fā)現(xiàn)miR-153 可通過JAK/STAT信號(hào)通路可調(diào)控膀胱癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力[21]；白藜蘆醇通過下調(diào)p-STAT3 的表達(dá)來抑制JAK/STAT3信號(hào)通路，從而抑制膀胱癌細(xì)胞的生長(zhǎng)[22]；白花蛇舌草也能通過JAK2/STAT3 通路誘導(dǎo)膀胱癌T24細(xì)胞凋亡[23]。本實(shí)驗(yàn)中，沉默LUCAT1會(huì)抑制Cyclin D1、p-JAK2、p-STAT 蛋白的表達(dá)，即抑制 JAK2/STAT3信號(hào)通路的激活，miR-493-5p抑制表達(dá)會(huì)逆轉(zhuǎn)沉默LUCAT1對(duì)JAK2/STAT信號(hào)通路的抑制作用。

綜上所述，沉默lncRNA LUCAT1 可抑制膀胱癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與上調(diào)miR-493-5p 及抑制JAK2/STAT 信號(hào)通路有關(guān)，將可為膀胱癌的預(yù)防和治療提供新靶點(diǎn)。