腎交感消融通過抑制氧化應激和過度自噬減輕大鼠心肌缺血再灌注損傷

胡晶晶 周偉 胡笑容

(1.鐘祥市人民醫院心內科，湖北 鐘祥 431900；2.武漢大學中南醫院，湖北 武漢 430071)

心肌梗死后再灌注治療是治療心梗最有效的方法，而再灌注損傷很大程度地限制了再灌注治療的療效。心梗后自主神經失衡，表現為交感神經過度激活，迷走神經活性相對減弱是加重心肌損傷和惡性心律失常的重要原因，而再灌注治療不能降低交感神經活性。研究[1]證實，迷走神經刺激可以通過增加迷走活性，相對抑制交感神經活性減輕心肌缺血再灌注(ischemiaandreperfusion，IR)損傷。因此抑制交感活性可能是治療心肌缺血再灌注損傷的可靠手段。腎交感消融(renalsympathetic denervation,RSD)是降低心臟交感活性的有效方法[2]，與左側星狀神經節消融為目前臨床研究最多的心交感神經消融方法，二者均可治療高血壓和特定類型的室性心律失常，如兒茶酚胺敏感型室速。RSD與心肌損傷研究鮮有報道，前期的研究[3]證實，RSD可以顯著抑制心梗模型中心交感活性和心肌氧化應激水平。本研究主要探討RSD對大鼠IR損傷的影響及可能機制。

1 材料與方法

1.1實驗分組與動物模型建立 18只18～20周齡雄性SD大鼠，體質量180～200 g，購于湖北省疾控中心。根據隨機數字表分為3組：假手術組，(SO組)：大鼠開腹暴露雙側腎臟，45 min后開胸、前降支下穿線不結扎；缺血再灌注組(IR組)：大鼠麻醉后開腹暴露雙側腎臟，45 min后開胸，結扎LAD 30 min，再灌注4 h；RSD+IR組:大鼠麻醉后開腹，暴露雙側腎臟，行RSD，RSD成功后等待30 min開胸，結扎LAD 30 min，再灌注4 h。

1.2RSD 暴露雙側腎臟后，剪斷腎門和腎動脈所有可見神經纖維，為保證RSD效率，用棉簽蘸取10%乙醇苯酚溶液濕敷腎門和腎動脈15 min。

1.3建立動物模型 大鼠采用2%苯巴比妥鈉腹腔麻醉(45 mg/kg)，將大鼠仰臥位固定于恒溫板上，剔除頸部、胸部和內側腹部毛發，在環狀軟骨下2節氣管插管(70 bpm，吸呼比1∶1.5，潮氣量1 mL)。沿腹部切口分離雙側腎臟，后沿左側胸部切口暴露心臟，剪開心包膜，在左心耳下2 mm處將LAD與中空帶凹槽的乳膠管結扎，結扎后遠處心肌變白表明結扎成功，缺血30 min后，剪斷結扎線，再灌注4 h。

1.4ELisa 檢測血清肌鈣蛋白I(cardiac troponin I，cTnI)和肌酸激酶同工酶(creatine kinase-MB，CK-MB)評價心肌損傷情況，檢測心肌組織間NE(interstitial norepinephrine，iNE)濃度，評價交感神經活性。經大鼠頸靜脈采血，離心(3 000 r×15 min)后取上清檢測。采用Elabscience公司試劑盒，嚴格按照說明書操作。檢測范圍：CK-Mb：31.25～2000 pg/mL；cTnI：31.25～2000 pg/mL；iNE：0.31～20 ng/mL。

1.5生物化學檢測法 檢測缺血區心肌(梗死心肌周圍5 mm內)超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)和總抗氧化能力(T-Aoc)，評價心肌組織氧化應激水平和抗氧化能力。選用南京建成生物工程研究所試劑盒，嚴格按照說明書操作。

1.6Western blot法 檢測缺血區心肌Beclin-1、LC3- Ⅱ評價心肌細胞自噬水平。勻漿后測定總蛋白濃度，每孔上樣量為40 μg，跑膠、轉膜后，與一抗(Beclin-1：1∶500稀釋，Abcam；LC3：1∶500稀釋，北京博奧森生物技術有限公司)4℃孵育過夜，與相應的二抗孵育后，ECL法顯色。

2 結 果

2.1心肌損傷 與SO組比較，IR組血清CK-Mb和cTnI表達均顯著增加。與IR組比較，RSD可以顯著降低血清CK-Mb和cTnI的表達。見表1。

表1 血清CK-Mb、cTnI及心肌組織iNE的表達

2.2心肌組織NE濃度 與SO組比較，IR組心肌組織中NE濃度顯著增加；與IR組比較，RSD組中NE濃度顯著降低。見表1。

2.3心肌氧化應激水平 與SO組比較，IR組缺血區心肌組織氧化應激水平(MDA)顯著增加，抗氧化能力(SOD，T-Aoc)顯著減弱；與IR組比較，RSD可以減輕缺血區心肌組織氧化應激水平，增加抗氧化能力。見表2。

表2 心肌MDA表達以及SOD和T-Aoc活性

2.4心肌自噬水平 與SO組比較，IR組中Beclin-1表達水平(0.75±0.11 VS 0.18±0.024，P<0.05)和LC3-Ⅱ(0.32±0.048 VS 0.087±0.0068,P<0.05)顯著增加；與IR組比較，RSD可以顯著抑制Beclin-1的表達(0.47±0.051，P<0.05)和LC3- Ⅱ(0.21±0.032，P<0.05)的表達。見圖1，表3。

圖1 Beclin-1和LC3-Ⅱ相對表達量

表3 心肌組織Beclin-1和LC3-Ⅱ相對表達

3 討 論

RSD為心交感消融的有效方法，前期大量研究[4-5]表明，RSD可以通過抑制心交感過度激活降低患者血壓以及缺血后房性、室性心律失常以及心衰的發生。RSD可以通過下丘腦室旁核，延髓頭端腹外側，雙側星狀神經節支配心臟交感活性。我們前期研究證實，RSD可以顯著抑制心梗后左側星狀神經節活性，即心交感活性，抑制室性心律失常的發生。本研究發現，RSD可以顯著抑制心肌組織NE水平，進一步印證了RSD為心交感消融的有效方法，可以顯著抑制IR中心交感過度激活。

交感過度激活是加重心肌IR損傷的重要因素，前期B.Buchholz等[6]研究證實，通過長時間低強度迷走神經刺激可以激活交感神經，進而加重心肌IR損傷，而這種作用可以完全被倍他樂克阻斷。組織中過高濃度的NE也是加劇IR損傷的重要因素，血清中NE濃度的過高也提示了不良預后[7-8]。本研究發現RSD可以顯著抑制心肌IR損傷，降低組織NE濃度，因此我們推測，RSD可以通過抑制交感活性和NE濃度減輕心肌IR損傷

心肌缺血時，氧供中斷、ATP耗竭，為保證機體所需，交感激活，增加心肌收縮力和心率，進一步加劇耗氧，導致心肌抗氧化能力耗竭，再灌注時富氧血流再通，引起局部心肌氧化/抗氧化失衡，氧化應激水平激增。過高的氧化應激水平可以持續開放線粒體膜通透性轉換孔，誘導線粒體腫脹破裂，呼吸鏈中活性氧大量釋放，進一步加重氧化應激。有研究表明，離斷交感神經可以減輕肝臟IR中氧化應激水平[9]。NE可以通過NADPH途徑誘導外周血單核細胞產生活性氧[10]。RSD減輕腦中氧化應激水平[11]，腎盂積水模型中，腎臟的氧化應激水平[12]。結合本研究結果我們推測，RSD可以通過抑制交感過度激活和組織中NE表達減輕大鼠心肌氧化應激水平，增加抗氧化能力。

自噬是心肌IR損傷的重要機制，目前普遍認為在缺血期自噬可以清除受損蛋白和細胞器，促進細胞存活，為保護機制，而再灌注時，由于自噬過度激活，可以促進細胞凋亡，為損傷機制。自噬可分為巨自噬、微自噬和分子伴侶介導的自噬，其中巨自噬為自噬的主要形式，損傷的細胞器或者大分子蛋白被雙層質膜包裹形成自噬小體，與溶酶體結合降解。目前認為VPS34-VPS15-Beclin-1復合物是激活自噬小體形成的關鍵酶復合物，其參與了磷脂酰肌醇(PI)磷酸化形成PI3P，而PI3P為形成自噬小體的必需物質。LC3-Ⅱ泛素化復合物是自噬小體形成的另一個重要介質，LC3-Ⅱ分布在自噬小體上，與溶酶體結合后降解，因此LC3-Ⅱ反應了自噬的水平。本研究發現RSD可以顯著抑制心肌組織Beclin-1的表達，降低LC3-Ⅱ的表達即抑制細胞巨自噬的水平。氧化應激可以通過多種途徑調節自噬水平，研究表明，過量活性氧可以通過抑制PI3K-Akt-mTOR通路、激活AMPK通路、抑制Atg活性等引起細胞內Beclin-1和LC3-Ⅱ的聚集，激活自噬[13]。因此我們推測RSD可以通過抑制氧化應激減輕心肌自噬水平。

綜上所述，RSD為心臟交感神經消融的有效方法； RSD可以通過抑制交感神經活性減輕大鼠心肌氧化應激和自噬水平，進而減輕大鼠心肌IR損傷； RSD減輕大鼠心肌自噬可能與抑制氧化應激有關。