離子色譜串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜測定嬰幼兒配方乳粉和牛乳中的肌醇

王 巖，王 娟，吳春敏，張春林，王 東，高 鐲，張雷雷，張 巖

（河北省食品檢驗研究院，河北 石家莊 050000）

肌醇為環(huán)己六醇，分子式為C6H12O6，易溶于水，不溶于乙醚、氯仿等，具有類似維生素的作用，最早由動物肌肉組織中提取，自然界中存在9 種肌醇的立體異構(gòu)體，其中最常見是肌-肌醇[1]。肌醇常被作為食品營養(yǎng)強化劑添加到保健食品、功能飲料和嬰幼兒配方食品中[2]，在嬰幼兒配方乳粉中屬于輔助添加性營養(yǎng) 物質(zhì)[3]，根據(jù)G B 1 0 7 6 5—2 0 1 0《嬰幼兒配方食品》 在嬰幼兒配方食品中肌醇的添加量為1.0～9.5 mg/100 kJ，是人體必需的營養(yǎng)因子，在人體內(nèi)以磷脂酰肌醇形式參與細(xì)胞膜的組成[4]，改善機體生長性能[5]，對嬰幼兒腦部和毛發(fā)發(fā)育有重要作用[6]，以及參與脂肪代謝[7]、抑制肝臟脂肪堆積[8]等功能。

目前，對于肌醇檢測常見的方法有酶法[9]、微生物法[10]、 氣相色譜法[11-12]、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[13-16]、離子色譜法[17]、液相色譜法[18]以及液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[19-21]、 毛細(xì)管電泳法[22]等，GB 5009.270—2016《食品中肌醇的測定》中方法為微生物法[23]和氣相色譜法[24]，其中液相色譜法對復(fù)雜樣品分離度較低[25]，微生物法時間較長，高錳酸鉀氧化法損失較大，氣相色譜法中樣品通過前處理發(fā)生衍生[26]，再上機測定其衍生物含量，上述方法一般都存在前處理復(fù)雜[27-28]、回收效果不理想、測定周期長、檢出限和定量限偏高等問題。目前鮮見采用離子色譜串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜法測定嬰幼兒配方乳粉和牛乳中肌醇的報道。

本實驗采用離子色譜串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜法測定嬰幼兒配方乳粉和牛乳中的肌醇含量，通過優(yōu)化實驗條件，建立適用于測定嬰幼兒配方乳粉和牛乳中肌醇含量的方法，該方法具有前處理過程簡單、回收率高、檢測時間短、檢出限和定量限低等優(yōu)點，實現(xiàn)肌醇快速檢測，以期為檢測嬰幼兒配方乳粉和牛乳中肌醇提供一種新途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

HCl（優(yōu)級純） 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；氨水、甲醇（色譜級） 德國Merck公司；IC-RP和IC-Ag固相萃取小柱、0.45 μm濾膜（MCM） 博納艾杰爾科技公司；肌醇標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（99.5%，200 mg） 上海安譜實驗科技股份有限公司；乳粉標(biāo)準(zhǔn)參考物質(zhì)QC-IP-707 中國檢驗檢疫科學(xué)研究院測試評價中心；乳粉標(biāo)準(zhǔn)參考物質(zhì)（SRM）1849a 美國NIST公司；超純水（電阻率為18.2 MΩ·cm）。

1.2 儀器與設(shè)備

Dionex ICS-5000+離子色譜儀、Dionex ICS-5000+EG淋洗液自動發(fā)生器、Dionex ASRS 300電解再生抑制器、 Dionex AS-AP自動進(jìn)樣器、TSQ Endura三重四極桿 質(zhì)譜儀 美國Thermo Scientific公司；VORTEX 3渦旋混勻器 德國IKA公司；3K15離心機 美國Sigma公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

稱取嬰幼兒配方乳粉0.50 g（牛乳樣品1.00 g），于100 mL容量瓶中，添加15 mL超純水溶解提取，充分振蕩搖勻，用鹽酸調(diào)節(jié)pH值到4.0～6.0，用超純水定容至刻度，9 000 r/min離心5 min，取5 mL上清液依次過0.45 μm濾膜、IC-RP和IC-Ag固相萃取小柱，前2 mL濾液棄掉，進(jìn)樣小瓶收集過濾液，待測。

1.3.2 色譜條件

考察Dionex IonPac AS16、Dionex IonPac AS19、Dionex IonPac AS20、Dionex CarboPac PA1和Dionex CarboPac MA1五種色譜柱對目標(biāo)物肌醇分離性和選擇性的影響，并對不同濃度淋洗液進(jìn)行選擇。淋洗液流速0.50 mL/min，柱溫30 ℃，進(jìn)樣體積20～50 μL，ASRS 300陰離子抑制器（2 mm，外接水模式）。

1.3.3 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源；負(fù)離子多反應(yīng)監(jiān)測模式；離子源溫度350 ℃；噴霧電壓2 500 V；碰撞氣流速0.15 mL/min；鞘氣流速40 mL/min；輔助氣流速10 mL/min；反吹氣流速0.4 mL/min。

1.3.4 基質(zhì)效應(yīng)

采用同一水平濃度下樣品基質(zhì)溶液和標(biāo)準(zhǔn)品溶液中肌醇強度響應(yīng)值的比值進(jìn)行評估，對同一水平濃度樣品進(jìn)行6 次重復(fù)測定。計算公式如下：

式中：α為基質(zhì)效應(yīng)/%；γ0為樣品本底響應(yīng)值；γ1為標(biāo)準(zhǔn)品的響應(yīng)值；γ2為樣品中添加標(biāo)準(zhǔn)品的響應(yīng)值。

1.3.5 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

精準(zhǔn)稱取10 mg肌醇純品固體于100 mL容量瓶中，用超純水定容，得到100 mg/L肌醇標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液；中間液為取1 mL肌醇標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液于100 mL容量瓶中，用超純水定容，得到1 mg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液；工作標(biāo)準(zhǔn)溶液是由中間液稀釋得到。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計及圖表繪制

采用TSQ Endura 2.1 Tune和Xcalibur軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計和處理，采用Origin pro8軟件進(jìn)行圖表繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件優(yōu)化

在電噴霧離子源負(fù)離子模式下，優(yōu)化肌醇檢測的質(zhì)譜條件，針泵連續(xù)進(jìn)樣，Q1全掃模式掃描母離子，碰撞母離子為m/z179.112，通過選擇離子掃描模式，調(diào)整鞘氣、輔助氣和反吹氣流速，分別得到子離子為m/z87.183和m/z117.054，采用信號穩(wěn)定、靈敏度高的子離子m/z87.183為定量離子，經(jīng)過條件優(yōu)化最終選擇的質(zhì)譜條件如表1所示。

表1 肌醇質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Mass spectrometry parameters for inositol

2.2 離子色譜條件優(yōu)化

2.2.1 色譜柱的選擇

選用Dionex IonPac AS16、Dionex IonPac AS19和Dionex IonPac AS20三種柱子時出峰不明顯，雜峰干擾多，選用Dionex CarboPac PA1色譜柱時基線不穩(wěn)，保留時間長，響應(yīng)值偏低，初期出現(xiàn)雜峰，而選用Dionex CarboPac MA1色譜柱保留時間短，10～11 min附近出峰，能夠?qū)崿F(xiàn)快速分離檢測，分離度好，峰形較為對稱，基線低且平穩(wěn)，出峰復(fù)現(xiàn)性好，因此，選擇Dionex CarboPac MA1色譜柱（2.0 mm×250 mm，7.5 μm）作為分析柱，Dionex CarboPac MA1型保護(hù)柱（2 mm×50 mm）。

2.2.2 淋洗液的優(yōu)化

在離子色譜分析測試中常見的淋洗液為碳酸鹽溶液和氫氧根溶液，氫氧根溶液具有低背景和靈敏度較高的特點，氫氧根溶液通過抑制器會生成水相再進(jìn)入質(zhì)譜檢測，對質(zhì)譜的污染小，提高質(zhì)譜的穩(wěn)定性，因此，淋洗液用KOH溶液。本實驗用KOH淋洗液自動發(fā)生器自動生成一定濃度的KOH溶液，避免了手工配制過程中空氣中CO2溶于淋洗液造成的基線漂移。

實驗采用梯度洗脫的方式，分別考察10、20、30、40、50 mmol/L濃度的KOH淋洗液對肌醇的分離洗脫效果。實驗發(fā)現(xiàn)，使用10 mmol/L和20 mmol/L低濃度的KOH淋洗液時，目標(biāo)峰寬較大，拖尾嚴(yán)重，響應(yīng)值相對偏低，而使用30、40 mmol/L和50 mmol/L的KOH淋洗液時，峰寬變窄，響應(yīng)值也有所提高，能夠?qū)崿F(xiàn)肌醇分離，但峰形對稱性不好，峰形較寬，有拖尾現(xiàn)象，影響積分定量，低濃度時易受基線干擾，而采用梯度洗脫，可以改善峰形，峰寬變窄，響應(yīng)值也有相應(yīng)的提高，因此，采用梯度洗脫的方式，梯度程序見表2。

表2 KOH溶液梯度洗脫程序Table 2 Gradient elution program with KOH solution

肌醇屬于弱極性化合物，在質(zhì)譜中采用電噴霧電離時不易發(fā)生電離，出現(xiàn)響應(yīng)值偏低、檢出限高、靈敏度低等問題，為改善這些問題，采用外加水模式在淋洗液中加入0.01%氨水-甲醇溶液，能夠明顯改善電離強度，提高檢測響應(yīng)值和改善峰形。

2.3 樣品前處理的優(yōu)化

嬰幼兒配方乳粉和牛乳中肌醇為游離態(tài)的肌醇，可直接用水溶解提取，振蕩搖勻，加酸使樣液中蛋白析出，離心取上清液過0.45 μm濾膜、IC-RP和IC-Ag固相萃取小柱，直接上機測定，樣品前處理過程簡單，避免待測目標(biāo)物的損失和提高樣品處理效率，樣品前處理過程明顯優(yōu)于現(xiàn)行國家標(biāo)準(zhǔn)中對乳粉測定采用的氣相色譜法。

2.4 基質(zhì)效應(yīng)

嬰幼兒配方乳粉及乳制品中含有復(fù)雜的組成成分，尤其含有大量的油脂和蛋白質(zhì)等有機大分子物質(zhì)，為盡可能降低樣品中的基質(zhì)效應(yīng)，本實驗通過樣品前處理優(yōu)化，用鹽酸溶液調(diào)節(jié)樣液pH值，再將樣液過濾膜和固相萃取小柱起到凈化的作用，極大程度降低基質(zhì)效應(yīng)。

結(jié)果表明，肌醇的基質(zhì)效應(yīng)平均比值為95.3%，基質(zhì)效應(yīng)在可接受范圍內(nèi)，樣品中的基質(zhì)對肌醇的測定影響不大，能夠保證結(jié)果的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性，因此本實驗可忽略基質(zhì)效應(yīng)對測定結(jié)果的影響。

2.5 方法線性范圍與檢出限

用肌醇標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)分別配制0.01、0.02、0.05、0.10、0.15、0.20、0.50、1.00、1.50、2.00、2.50、3.00 μg/mL系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，以肌醇定量離子對的峰面積為Y軸，系列標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度為X軸進(jìn)行線性回歸，回歸方程為Y=7 563.09＋315 926.4X，r＝0.999 8，線性良好。

稱取不含肌醇的嬰幼兒配方乳粉作為空白樣品，加入一定濃度的肌醇標(biāo)準(zhǔn)溶液，當(dāng)信噪比為3時的樣品含量為檢出限，當(dāng)信噪比為10時的樣品含量為定量限，因此，方法檢出限和定量限分別為0.023 mg/100 g和0.076 mg/100 g，檢出限和定量限均低于國家標(biāo)準(zhǔn)中固體或粉末樣品檢出限1.0 mg/100 g和定量限3.0 mg/100 g。

2.6 樣品回收率與精密度

用本方法測定乳粉標(biāo)準(zhǔn)參考物質(zhì)樣品QC-IP-707（131.1 mg/100 g）和1849a（40.5 mg/100 g）（n=6）的回收率分別為99.1%和100.1%，如圖1所示。向標(biāo)準(zhǔn)參考物質(zhì)樣品乳粉、嬰幼兒配方乳粉和牛乳中按本底50%、100%和200%不同水平添加肌醇標(biāo)準(zhǔn)溶液，混勻靜置1 h，按照1.3.1節(jié)前處理方法處理樣品，樣品回收率和精密度結(jié)果如表3所示。肌醇的加標(biāo)回收率在90.3%～109.5%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.7%～9.1%之間，滿足嬰幼兒配方乳粉和牛乳中肌醇含量的分析要求。

圖1 QC-IP-707（A）和1849a（B）中肌醇色譜圖Fig. 1 Chromatograms of inositol in QC-IP-707 (A) and 1849a (B)

表3 不同添加水平下乳粉和牛乳中肌醇的回收率和精密度（n=6）Table 3 Recoveries and RSDs of inositol at different spiked levels in milk powder and milk samples (n = 6)

2.7 實際樣品的測定結(jié)果

市場隨機購買10 批次嬰幼兒配方乳粉和牛乳，采用該方法檢測其中肌醇含量，結(jié)果如表4、圖2所示。結(jié)果說明不同品牌的嬰幼兒配方乳粉之間肌醇含量存在一定差異。

表4 嬰幼兒配方乳粉和牛乳中肌醇含量Table 4 Inositol contents in infant formula and milk mg/100 g

圖2 嬰幼兒配方乳粉樣品（A）和牛乳（B）中肌醇色譜圖Fig. 2 Chromatograms of inositol in infant formula (A) and milk (B)

3 結(jié) 論

本實驗采用離子色譜串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜法測定嬰幼兒配方乳粉和牛乳中的肌醇含量。通過優(yōu)化樣品前處理方法、淋洗液成分、質(zhì)譜參數(shù)，選擇合適的分離色譜柱和母離子與子離子的離子對，建立一種測定嬰幼兒配方乳粉和牛乳中肌醇含量的方法。該方法能夠獲得較好的分離效果、回歸線性和高靈敏度，檢出限和定量限均低于國家標(biāo)準(zhǔn)，且方法簡單快捷，能實現(xiàn)快速檢測，完全適用于嬰幼兒配方乳粉和牛乳中肌醇的測定。