基于氣相色譜-離子遷移譜結合多元統計學分析KCl部分替代NaCl對宣威火腿揮發性 風味化合物的影響

丁習林，王桂瑛,，鄒穎玲，趙婭英，葛長榮，廖國周,

（1.云南農業大學食品科學技術學院，云南 昆明 650201；2.云南農業大學云南省畜產品加工工程技術研究中心，云南 昆明 650201）

宣威火腿是云南傳統名特優肉制品[1]，以營養豐富、滋味鮮美、油而不膩、香氣濃郁著稱于世。多年來，由于產品含鹽量普遍較高，口感偏咸，嚴重影響其消費及火腿產業的發展。食鹽是目前導致高血壓和心血管疾病等的一個重要因素[2-4]，降低鈉鹽攝入量可有效降低血壓和患中風以及冠心病的風險[5-6]。因此，有必要減少宣威火腿中的鈉鹽含量，降低消費者食鹽攝入量或使用鈉鹽的替代物，以滿足消費者對宣威火腿的健康要求。

國內外學者通過降低肉制品中NaCl的添加量和利用其他鹽部分替代NaCl[7]。然而，NaCl在干腌火腿中具有重要的作用[8]，減少火腿中NaCl添加量具有挑戰性。有研究表明，用替代鹽部分替代NaCl似乎是降低干腌火腿鈉含量的最佳選擇[9]。而KCl與NaCl性質較為相似，大量研究表明，適宜替代量的KCl對干腌肉制品的品質不會產生明顯的不利影響[10-11]。在滿足低鈉干腌火腿要求的前提下，其風味是評價火腿品質的主要指標之一。目前，火腿風味的鑒定與表征常采用氣相色譜-質譜聯用和液相色譜[12]。現有技術中也有使用電子鼻進行評定[13-15]，但是檢測的精密度較差，成分難以定性。與其他技術相比，氣相色譜-離子遷移譜（gas chromatography-ion mobility spectrometry，GC-IMS）技術是基于GC中不同的氣相離子在電場中遷移速率的差異檢測痕量氣體和表征化學離子物質的分析技術。該檢測技術克服IMS技術分離度差的局限性，使得離子遷移譜信號響應經GC預分離后質量上得到顯著改善[16]，通過GC保留時間和IMS漂移時間具有實現二維分離的潛力。具有靈敏度高、分析速度快、操作簡單等優點，且樣品幾乎不需要任何前處理。由于其相對于傳統分析技術的諸多優勢，近年來在食品質量和食品安全方面的應用不斷增加，包括食品摻假及產地的鑒別、新鮮度和貯存條件的判定、質量評價和優化、食品成分分析等[17-19]。GC-IMS已被證明可用于分析和表征不同性質樣品（如肉制品）中的揮發性化合物[20-21]。 同時，結合多元統計學方法，主成分分析（principal component analysis，PCA）、偏最小二乘-判別分析（partial least squares-discriminant analysis，PLS-DA）等分析不同KCl替代組中揮發性風味的差異。

本研究通過使用不同比例KCl部分替代NaCl，采用GC-IMS技術對不同KCl替代鹽火腿中的揮發性風味物質進行檢測。結合PCA和PLS-DA等多元統計分析方法，分析不同KCl替代量的宣威火腿揮發性風味的差異，旨在為低鈉鹽宣威火腿的開發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

選用同批次飼養10月齡的含烏金豬血統的宣和豬，統一屠宰后取豬后腿25 條作為原料腿，平均腿質量為（14.77±0.72）kg。于云南省宣威市浦記食品火腿有限公司進行腌制發酵成熟。所有分離用有機溶劑、滴定標準液及指示劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

FlavourSpec?食品風味分析與質量控制系統（配有自動頂空進樣器、Laboratory Analytical Viewer（LAV）分析軟件及GC-IMS Library Search定性軟件） 德國G.A.S 公司；BZBJ-20型斬拌機 杭州艾博科技工程有限公司。

1.3 方法

1.3.1 試驗設計

采用單因素試驗設計，將25 條豬后腿隨機分成5 組，每組5 條。根據國內外干腌肉制品KCl替代NaCl比例的相關研究，替代的最大可接受比率在50%～60%[22-23]之間，結合已有研究結果設計KCl的替代比例。以100% NaCl為對照，使用KCl分別替代30%、40%、50%和60% NaCl的宣威火腿。

1.3.2 宣威火腿的加工

按照傳統宣威火腿的加工工藝進行。各組不同替代量KCl分別與對應的食鹽混合，腌制時食鹽和鉀鹽的添加量為鮮腿質量的6.5%。其工藝流程主要包括：修割定型、上鹽腌制、堆碼翻壓、洗曬整形、上掛風干和發酵管理等基本步驟。將鮮豬腿在0～4 ℃冷卻48 h，經冷藏并修割定型的鮮腿上鹽腌制，分3 次上鹽，每次間隔2～3 d，腌制間室內溫度保持在7～10 ℃之間，相對濕度保持在65%～80%之間；堆碼腌制12～15 d，每隔3～5 d翻壓一次；經堆碼翻壓的腌制腿洗曬整形后進行上掛風干，后期發酵平均溫度保持在13～16 ℃之間，相對濕度保持在72%～80%之間。加工時間從2017年11月到2018年11月。火腿的加工及發酵均于云南省宣威市浦記食品火腿有限公司進行。

1.3.3 樣品制備

宣威火腿經洗霉修割后分別取各組火腿股二頭肌為樣品，除去脂肪和結締組織，用斬拌機斬碎后，可直接用于檢測。每組取3 個樣品，共15 個樣品用于GC-IMS分析，其中每個樣品平行測定2 次。

1.3.4 GC-IMS測定

采用GC-IMS氣味分析儀對不同替代鹽火腿樣品產生的揮發性有機物進行檢測分析。取1 g樣品于20 mL頂空進樣瓶中，60 ℃孵化20 min，經頂空進樣用GC-IMS儀FlavourSpec?進行測試，經G.A.S.開發的功能軟件分析可給出樣品中揮發性有機物的差異譜圖；軟件內置的NIST數據庫和IMS數據庫可對物質進行定性分析。GC-IMS分析的主要檢測參數如表1所示。

表1 GC-IMS分析參數Table 1 Working parameters for GC-IMS analysis

1.4 數據處理

采用設備自帶儀器分析軟件， 包括L A V（Laboratory Analytical Viewer）和插件（Reporter、Gallery plot），以及GC×IMS Library Search定性分析軟件對不同替代鹽火腿的揮發性有機物進行采集和分析；SIMCA-P14.1用于PCA和PLS-DA；熱圖和聚類分析采用TBtools軟件繪制。

2 結果與分析

2.1 不同KCl替代組宣威火腿中揮發性化合物的 GC-IMS分析

采用頂空-GC-IMS對不同替代鹽火腿揮發性化合物進行分析和鑒別。GC-IMS能確定3 個獨立的參數，即分析物在氣相色譜柱中的保留時間、離子化合物在IMS漂移管中的分離時間、每個離子化合物到達IMS漂移管檢測器的量（信號強度），這些數據可以用三維圖表示。不同遷移率的離子需要不同的時間通過固定的距離（漂移管長度）向檢測器漂移，因此在不同時間（漂移時間）內被檢測。在漂移過程中，離子與漂移氣體的中性分子發生碰撞。與小分子相比，大分子在相同時間內會發生更多的碰撞，因此它們的漂移速度較慢[24]。

采用GC-IMS分析不同KCl替代鹽火腿樣品中揮發性成分的差異，如圖1所示，從不同替代組火腿樣品中各選取1 個樣品，整個譜圖即代表了樣品的頂空成分，反應離子峰（reaction ion peak，RIP）兩側的每個點代表從樣品中提取的揮發性化合物。顏色代表物質的含量，淺藍色表示低含量，紅色表示高含量，顏色越深表示含量越高。不同KCl替代組的火腿間揮發性組分可通過GC-IMS技術很好分離，且可直觀看出不同替代組的揮發性化合物差異。不同替代鹽的火腿揮發性有機物的差異主要表現在離子峰的位置、數量、強度及時間上。

2.2 不同KCl替代組宣威火腿中揮發性化合物差異分析

為進一步直觀觀察不同KCl替代組宣威火腿的揮發性有機化合物的變化，根據火腿揮發性物質GC保留時間和離子遷移時間對揮發性組分進行定性分析，然而，在GC-IMS中，許多揮發性物質由于濃度不同會產生不同的產物離子，如單體、二聚體和異構體，這些產物的保留時間相似，但漂移時間不同。通過軟件內置的NIST 2014保留指數數據庫與G.A.S.的IMS遷移時間數據庫，確定49 種具體揮發性物質組成（圖2， 表2），主要包括醛類19 種、醇類9 種、酮類11 種、酯類9 種和酸類1 種。

圖1 不同KCl替代組宣威火腿中揮發性化合物的GC-IMS圖譜Fig. 1 GC-IMS profiles of volatile compounds in Xuanwei hams with different levels of KCl substitution

圖2 宣威火腿樣品中揮發性化合物特征峰位置點Fig. 2 Characteristic peak location points of volatile compounds in Xuanwei ham samples

表2 宣威火腿揮發性組分的定性Table 2 Volatiles in Xuanwei ham identified by GC-IMS

續表2

為進一步比較不同替代鹽火腿中揮發性有機物質的差異，G.A.S.公司開發的LAV軟件的Gallery Plot插件，可選取圖中待分析區域，自動生成指紋圖譜。選取的區域編號與圖2和表2中的標記編號一一對應。如圖3所示，每個特征峰的顏色代表強度，藍色為背景，紅色代表物質成分，紅色越深表示含量越高。根據檢測到的風味化合物，所建指紋圖譜清晰地反映不同KCl替代量的宣威火腿各類風味化合物的差異。40% KCl替代組中丁酸乙酯、3-甲基丁酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、2-甲基丙酸乙酯、乙酸乙酯的含量較高；乙縮醛在40%～60% KCl替代組中，而在對照組（100% NaCl）和30% KCl替代組中含量最低；此外，在本研究中，對照組和30% KCl替代組中的己醛含量明顯高于其他替代組；壬醛、正辛醛和戊醛等在對照組中含量較高，而在使用了KCl替代后其含量明顯低于對照組。

圖3 不同KCl替代組宣威火腿中揮發性化合物的指紋圖譜Fig. 3 Fingerprints of volatile compounds in Xuanwei hams with different levels of KCl substitution

2.3 不同KCl替代組宣威火腿中揮發性化合物多元統計分析

2.3.1 基于PCA對不同KCl替代組宣威火腿的區分

圖4 PCA得分圖（A）和Hotelling T2分布圖（B）Fig. 4 PCA score plot (A) and Hotelling T2 value range plot (B)

近年來，隨著風味檢測技術的發展和多元統計分析技術的普及，統計分析方法被廣泛應用于肉制品的化學識別及其風味特征成分的研究。PCA可以根據主成分因子在不同樣本中的貢獻率評價樣本之間的規律性和差異性[25]。利用火腿揮發性風味組分的信號峰強度進行PCA，如圖4A所示，共獲得4 個PC，累計＝0.685，Q2＝0.418，雖然模型擬合性較好，但由于Q2小于0.5，表明模型預測能力較差。從樣本的聚集、離散程度可知，不同KCl替代組宣威火腿樣本分布均有聚集的部分，也均有離散的部分，表明火腿樣本中均存在差異較大的樣本，因為樣本分布點距離越近，說明這些樣品中所含有的化合物的組成和含量越接近，而這些化合物的組成和含量接近可能是相同處理組間的聚集，也有可能是不同處理組但是化合物含量上相近；反之，樣本點距離越遠，其差異就越大，這與以上Q2數值較小的原因一致。但是所有樣品均處于95% Hotelling T2置信區間內，沒有發現“離群樣本點”，如圖4B所示。PCA屬于無監督分析方法，不能忽略組內誤差、消除與研究目的無關的隨機誤差，因此，并不能直接區分不同KCl替代組的宣威火腿，之后將采用有監督的方法進行進一步研究。

2.3.2 基于PLS-DA對不同KCl替代組宣威火腿的區分

圖5 不同KCl替代組宣威火腿PLS-DA得分圖（A）和置換保留圖（B）Fig. 5 PLS-DA scores plot (A) and permutations plots (B) of Xuanwei hams with different levels of KCl substitution

PLS-DA是基于降維的多維向量分析方法，與PCA不同的是，PLS-DA為有監督的分析，可以預設分類，彌補了PCA方法的不足，強化組間的差異，同時可以量化特征化合物造成組分差異的程度[26-27]。如圖5A所示，累計R2X＝0.784，R2Y=0.947，Q2＝0.791，說明該模型對不同KCl替代組宣威火腿具有良好的穩定性和較好的預測能力，相比于PCA，PLS-DA使組間差異更明顯。采用置換檢驗對PLS-DA模型進行驗證（重復次數200），以獲取隨機模型的R2和Q2，可作為衡量模型是否過擬合以及在評估模型的統計顯著性上有重要作用。如圖5B所示，最右側的R2和Q2值均高于左側的R2和Q2值，R2＝0.46，Q2＝-0.825，Q2為負值表明回歸線與橫坐標交叉或小于0， 從而證明該PLS-DA模型可靠，未存在過擬合現象，且有較好預測能力[28]，可以用于解釋不同KCl替代量的宣威火腿風味的差異。

2.3.3 不同KCl替代組宣威火腿揮發性特征標志物的篩選與分析

基于P L S-D A 模型分析結果，變量重要性投影（variable important for the projection，VIP）可以量化PLS-DA的每個變量對分類的貢獻，通常將VIP值大于1表示在判別過程中具有重要作用。VIP值越大，變量在不同KCl替代組火腿間的差異越顯著[29]。其中，以VIP大于1為潛在的揮發性特征標志物，共篩選出24 個潛在的揮發性特征標志物（表3），包括醇類5 種、醛類6 種、酯類6 種和酮類7 種。為了直觀觀察不同KCl替代組宣威火腿風味標志物的差異，依據每個風味標志物的峰強度值繪制熱圖。如圖6所示，100% NaCl（對照組）和30% KCl替代組的風味標志物聚為一類，40%～60% KCl替代組的風味標志物聚為一類，其中I區的風味標志物其含量隨KCl替代量的增加有逐漸減低的趨勢；II區的風味標志物其含量在不同KCl替代組間的變化主要呈現先增加后降低的趨勢，在40% KCl替代組中達到最大。

從表3可知，以峰強度值代表各揮發性化合物含量的高低，特別是丙酸乙酯、2-戊酮（M）、乙酸乙酯（D）和乙縮醛等，其VIP值大于1.2，是影響不同KCl替代組宣威火腿風味差異的重要成分。其中，丙酸乙酯在40% KCl替代組中的含量最高，且顯著高于對照組和其他替代組（P＜0.05），除40% KCl替代組外，各實驗組間均無顯著差異（P＞0.05）。2-戊酮（M）含量在對照組中最低，KCl的替代使2-戊酮（M）的含量顯著增加 （P＜0.05）。乙酸乙酯（D）含量隨KCl替代量的增加呈先增加后降低的趨勢，在40% KCl替代組中達到最大。乙縮醛在對照組和30% KCl替代組中含量極低，而當KCl的替代量達到40%及其以上時，其含量與對照組和30% KCl替代組相比顯著增加（P＜0.05）。3-甲基丁醛是重要的甲基醛，當KCl替代量超過30%時，3-甲基丁醛顯著降低（P＜0.05）。此外，1-辛烯-3-醇、異丁酸乙酯（M）、2-戊酮（M）、2-戊酮（D）和4-甲基-2-戊酮（M）等均在對照組中含量最低，而KCl的替代使其含量增加。同時，KCl的替代也會使一些揮發性風味物質含量顯著降低，如芳樟醇、苯甲醛、2-丁酮（M）等。

表3 不同KCl替代組宣威火腿風味特征標記物峰強度值Table 3 Peak intensity values of characteristic marker flavor substances in Xuanwei hams with different levels of KCl substitution

圖6 不同KCl替代組宣威火腿風味特征標記物熱圖和聚類分析圖Fig. 6 Cluster heat map of characteristic marker flavor substances in hams with different levels of KCl substitution

3 討 論

在宣威火腿的加工過程中，NaCl發揮了重要的作用，它會影響蛋白與脂肪的分解氧化等化學和生化反應，最終影響火腿風味的形成[30]。NaCl含量的變化會導致干腌肉制品風味的變化[31]。本研究檢測出的風味化合物主要包括醛類、醇類、酮類、酯類和酸類等。其中醛類物質由于風味閾值較低，在整個產品風味中起著至關重要的作用[32]，即使微量，也是火腿中最重要的一類風味化合物[33-34]。唐靜等[35]通過氣味活度法對金華火腿風味進行檢測鑒定，得到11 種主體揮發性化合物，其中 3-甲基丁醛、辛醛、壬醛、庚醛、己醛等在本實驗中也有檢出。蘇偉等[36]通過PLSR相關性分析顯示，肉香與 3-甲基丁醛、己醛及壬醛含量有關。在本實驗中，己醛含量在KCl替代量超過30%時明顯降低，這與Armenteros等[9]的研究結果一致。2-甲基丁醛和3-甲基丁醛是蛋白水解及亮氨酸和異亮氨酸經Strecker降解的產物，具有奶酪、堅果和成熟火腿的氣味，且對火腿的整體風味有重要貢獻[37]。在本研究中當KCl替代量超過30%，3-甲基丁醛含量低于對照組，這可能是由于KCl較高比例替代NaCl抑制了蛋白質水解，從而抑制了火腿中氨基酸的生成。Wu Haizhou等[38]發現70% KCl替代NaCl抑制了干腌培根中蛋白質水解。

醇類物質由于其風味閾值相對較高，對干腌火腿總體風味的貢獻較小[39]。其中比較具有代表性的是脂肪酸β氧化的產物1-辛烯-3-醇，它具有蘑菇味香氣，香氣閾值較低，是火腿中重要的香氣成分，在本研究中1-辛烯-3-醇在對照組中最低，而KCl的替代使其含量增加，這與唐靜[37]使用40% KCl替代干腌火腿中的結果基本一致，可能是因為KCl能夠促進脂肪的氧化，進而促進1-辛烯-3-醇的生成。

有些風味化合物可由多種途徑產生，氨基酸降解、脂肪氧化以及由于微生物的作用等，如丙酮等一些小于6 個碳原子的脂肪族化合物[40]。有研究認為[41]酮類化合物尤其是2-酮類化合物對肉類和肉制品的風味有重要作用。在本研究中，2-戊酮是重要的風味特征標記物，KCl的替代均使2-戊酮的含量顯著增加，Zhang Yingyang等[33]的研究中也得到類似的結論。酯類化合物是一種重要的揮發性化合物，由于其閾值較低，使得發酵肉制品具有獨特的風味[42]。在本研究中酯類風味標記物質均呈現出隨KCl替代量的增加其含量呈先增加后降低的趨勢，因為在火腿中一定濃度的KCl可能會加速蛋白質水解[43]，生成更多的醇類，并與游離脂肪酸反應形成更多的酯類，這與Zhang Yingyang等[33]研究結果基本一致，而隨后降低則可能是由于水分含量的增加導致。此外，KCl替代量不超過60%時，苯甲醛含量隨鉀鹽替代比增加而降低， 童紅甘[44]在鉀鹽替代對傳統板鴨風味品質的影響研究中也得到類似的結論。

4 結 論

本研究采用GC-IMS對KCl不同替代量宣威火腿中的揮發性成分進行分析檢測，共定性識別出了49 種揮發性化合物，包括醛類19 種、醇類9 種、酮類11 種、酯類9 種和酸類1 種。同時結合多元統計學方法分析不同KCl替代組宣威火腿中的揮發性成分的變化，通過PCA、PLS-DA均可直觀對不同KCl替代組宣威火腿中的揮發性成分進行有效區分，利用PLS-DA建立的相關模型，得出VIP相關物質共24 種，其中丙酸乙酯、2-戊酮（M）、乙酸乙酯（D）和乙縮醛等，是影響不同KCl替代組宣威火腿風味差異的重要成分。此外，通過熱圖聚類分析，對照組與30% KCl替代組宣威火腿在風味上較為相似，當KCl替代量超過30%，3-甲基丁醛含量低于對照組，此外，1-辛烯-3-醇、異丁酸乙酯（M）、2-戊酮（M）、 2-戊酮（D）和4-甲基-2-戊酮（M）等均在對照組中最低，而KCl的替代使其含量增加。乙酸乙酯、異丁酸乙酯、3-甲基丁酸乙酯和2-甲基丁酸乙酯等酯類化合物在30%和40% KCl替代組中含量較高，但當KCl的替代量超過40%時，其含量降低。KCl部分替代NaCl改變了宣威火腿揮發性化合物的形成，最終影響了火腿的風味。綜上，為了保持傳統宣威火腿的風味，KCl替代量不應超過30%，因此，可減少30%的NaCl添加量，有助于生產低鹽健康的宣威火腿。