限食后重飼大鼠軀干脂肪改變對骨密度的影響及機制

王素星，邵偉華，王 娜，呂彩霞

(河北省人民醫院老年病二科，河北 石家莊 050051)

限食后重飼，為短期熱卡限制后重新開放飲食，可導致能量攝入的波動。不適當限食減肥后飲食反彈、疾病和疾病的康復等均伴隨熱卡攝取的波動[1]。脂肪組織是人體最大的能量儲存庫，通過脂肪合成、脂肪動員儲存或釋放能量,應對進食、運動、饑餓等代謝應激[2]。故飲食改變可影響脂肪組織的代謝，而軀干部因其特殊解剖特點，成為脂肪更易聚集的部位。同時，能量攝入的波動多伴隨有體重的改變，進而使骨骼的承重負荷發生變化，極有可能影響骨代謝。近年來隨著對脂肪功能研究的深入，有關脂肪組織的不同分布類型對骨密度的作用也被不斷發現，認為脂肪分布可獨立于全身脂肪含量而對骨發生作用。在短期熱卡攝入波動模型上，軀干部位的脂肪改變情況是怎樣的，與骨密度關系怎樣，值得研究。熱卡攝入的質和量是一個可控因素，所以探討能量波動與疾病之間的關系具有重要意義。雙能X線吸收測量法是目前檢測體成分與骨密度的最有效的手段[3]，并可對不同部位的脂肪含量進行準確評估，其檢測的軀干脂肪含量可作為肥胖的替代表型[4]。因此本研究以限制熱卡，進而快速恢復不同飲食模式的成年大鼠為模型，檢測軀干體脂含量及全身骨密度，觀察營養改變過程中不同膳食模式對軀干脂肪含量及骨密度的影響，以及二者之間的關系。

1 材料與方法

1.1材料 SPF級SD雄性大鼠40只，體質量(160±20)g，購自河北醫科大學科研實驗動物飼養中心。實驗動物質量合格證號:SCXK(冀)2013-1-003。

1.2研究方法 實驗大鼠適應性喂養1周后，隨機分為5組，實驗周期分為4周和12周。4周組分為正常飲食組(normal control 4 week，NC4)和熱卡限制(calorie restriction for 4 weeks,R4)組，12周組分為正常飲食組(normal control 12 week，NC12)、限制飲食后重飼普通飲食組[(refeeding with normal chow，RN)，限食4周+8周正常飲食]、限制飲食后重飼高脂飲食組[(refeeding with high-fat diet,RH)，限食4周+8周高脂飲食]。動物及普通飼料均購自河北醫科大學實驗動物學部，高脂飼料配制參閱國外配方[5]。所有實驗程序均經我院倫理委員會批準。

1.3指標檢測

1.3.1體重測量 電子秤稱取實驗動物每日體重及食物攝入質量(精確至0.1 g)。

1.3.2軀干脂肪含量、軀干脂肪比例與骨密度測定 分別在實驗的第4、12周末時，大鼠禁食過夜，精確稱量體重，按30 mg/kg腹腔注射戊巴比妥，待動物肌力消失，呼吸平穩，仰臥位將四肢用膠帶固定于硬紙板，從鼻尖掃描至尾端，選用美國GE Lunar公司生產的雙能X線吸收測量儀行軀干脂肪含量、軀干脂肪與全身脂肪比例及全身骨密度測定。

1.3.3腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α,TNF-α)及白細胞介素6(interleukin-6，IL-6)檢測 采用酶聯免疫吸附測定試劑盒(Pierce公司)，按試劑盒說明操作。

1.3.4三酰甘油(triglyceride，TG)及游離脂肪酸(free fatty acids,FFA)檢測 TG采用脂蛋白脂肪酶-甘油磷酸氧化酶-過氧化物酶-4-氨基安替比林和酚法測定，按說明書操作。FFA測定采用酶聯免疫吸附劑測定試劑盒，具體操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.3.5胰島素檢測 放免法測定血漿胰島素的濃度，遵照胰島素放免試劑盒說明書逐步進行。

1.3.6骨轉換標志物檢測 全自動生化分析儀測定血清堿性磷酸酶水平,嚴格按照試劑盒說明書運用酶聯免疫吸附法測定血清骨鈣素濃度,在450 nm波長下測光密度值(OD值),計算血清骨鈣素含量。

1.4統計學方法 應用SPSS 17.0統計軟件分析數據，本研究限于同周齡實驗大鼠組內比較，計量資料比較分別采用F檢驗，SNK-q檢驗和獨立樣本t檢驗。符合正態分布的兩指標相關分析采用Pearson相關分析，不符合正態分布的兩指標相關分析采用Spearman相關分析。使用多元逐步回歸分析比較全身骨密度與各個變量之間的關系，同時行共線性檢驗，排除相關性強的影響因素。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1體重比較 5組熱卡限制4周后，R4組與NC4組比較，體重顯著下降(P<0.01)；重飼后，RN及RH組體重均有不同程度提升，但較NC12仍為低，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 5組體重比較

2.2軀干脂肪及骨密度比較 R4組軀干脂肪含量及軀干與全身脂肪比例在熱卡限制期與NC4組比較，差異無統計學意義(P>0.05)，但R4組全身骨密度下降明顯，與NC4組相比，差異有統計學意義(P<0.05)。重飼后，軀干脂肪含量及軀干與全身脂肪比例均明顯升高(P<0.05)，尤其是以RH組為著，但與RN組差異無統計學意義(P>0.05)。RN組的全身骨密度達到NC12組水平，RH組的全身骨密度仍明顯低于NC12組，亦較RN組顯著降低(P<0.05)。見表2。

表2 軀干脂肪和骨密度比較

2.3FFA、TG及血清胰島素(fasting serum lisulin，FINS)水平比較 R4組TG下降明顯，與NC4組相比，差異有統計學意義(P<0.05)，FINS、FFA變化不明顯。重飼后，RN及RH組血清FFA、TG及FINS水平均顯著高于NC12組水平(P<0.01)，其中RH組FINS及FFA水平亦較RN組明顯升高(P<0.05)。見表3。

表3 血清FFA、TG及FINS水平比較

2.4炎癥因子比較 熱卡限制使R4組血清TNF-α、IL-6水平明顯降低，與NC4組相比，差異有統計學意義(P<0.01)。開放飲食后，RN及RH組血清TNF-α、IL-6水平較NC12組比較均顯著升高(P<0.01)，以RH組升高顯著(P<0.05)。見表4。

2.5血清骨轉換標志物水平比較 熱卡限制使R4組血清堿性磷酸酶、骨鈣素水平明顯降低，與NC4組相比，差異有統計學意義(P<0.01)。重飼后，RN及RH組血清堿性磷酸酶、骨鈣素水平有所提升，但仍明顯低于NC12(P<0.05)。見表5。

表5 血清骨轉換標志物水平比較

2.6Pearson′s相關分析 全身骨密度與體重、堿性磷酸酶、骨鈣素呈正相關(r=0.662、0.613、0.589，P<0.05)；與軀干脂肪含量、軀干脂肪比例、FISN、FFA、TNF-α、IL-6成負相關(r=-0.818、-0.794、-0.623、-0.649、-0.662、-0.537，P<0.05)。進一步行逐步回歸分析顯示軀干脂肪含量、軀干脂肪比例是影響全身骨密度的重要因素(r2=0.823，P<0.001)。

3 討 論

因疾病或其他原因導致機體暫時能量攝入減少，隨著不利因素解除，飲食恢復，進而可補充前期能量不足時機體的消耗。故機體能量攝入的波動是一種常見的病理生理現象，這個過程中各系統發生的代謝改變越來越引起人們的關注[6]。研究證實體成分受能量供應及飲食的影響[7]。有研究報道，給予40%～60%熱卡限制后，大鼠脂肪組織減少明顯[8]。然而本研究顯示限食階段軀干脂肪含量及與全身脂肪比例變化不明顯。考慮本研究與其他研究熱卡限制程度及時間、飼料成分存在差異等有關。但熱卡限制導致骨密度下降明顯，這與眾多研究結果相一致[9-10]。飲食恢復后，RN及RH組均表現出軀干脂肪堆積的現象，至飲食恢復8周時，軀干脂肪含量及與全身脂肪比例均顯著高于NC組，以RH組為著。同時實驗結束時，高脂重飼RH組全身體重指數恢復程度較普通飲食重飼RN組為差。兩組重飼實驗動物在體重尚未完全恢復的情況下，均出現軀干脂肪堆積明顯，并伴隨全身骨骼密度降低，我們推測在該模型上，軀干部位的脂肪堆積對骨代謝產生了負性影響。

需要注意的是，熱卡限制是重飼以正常飲食RN組與正常對照NC組的唯一不同之處，我們考慮熱卡限制可能是限食后重飼模型軀干脂肪及骨密度改變的始動因素，這可能與熱卡限制激活了能量節約代謝機制密切相關。另外，相對于正常飲食重飼，高脂重飼對機體代謝影響更為明顯。我們分析高脂再喂養較正常飲食提供了更多熱量，而調節營養底物氧化代謝是機體適應不同生理及營養狀況的一種重要機制。有研究顯示實驗動物在限食期間對脂肪的氧化能力低于碳水化合物[11]。提示營養底物供應模式的轉變是導致限食后重飼模型中脂質堆積的重要原因。同時，熱卡限制降低了成骨細胞活性和骨形成，損害骨礦化和生物力學[9-10]，重飼以高脂飲食后，高脂飲食本身及更為顯著的軀干脂肪堆積進一步加劇了骨破壞，故至實驗結束，RH組骨密度恢復程度較RN組為差。

肥胖與骨代謝的關系錯綜復雜，既往研究表明，超重或肥胖者骨質疏松或骨質疏松性骨折發病風險下降，體重和骨密度呈正相關[12-13]。其原因之一可能為增加的體重加大了對骨骼的重力負荷和機械刺激。然而近年來肥胖與骨密度的關系出現了爭議，有研究表明在去除了體重對于骨礦密度的作用后，發現脂肪組織的增加并不能預防骨質疏松,甚至可能產生負性的影響[14]。在本研究中，我們發現重飼后軀干脂肪增多，機體出現高胰島素血癥。有研究報道血胰島素水平不足是糖尿病患者發生骨質疏松原因之一,外源性補充胰島素可刺激成骨細胞內骨基質的合成,促進成骨細胞攝取葡萄糖,進而使骨基質和骨密度增加[15]。對此我們考慮對于單純胰島素不足，補充胰島素可促進骨形成，預防骨質疏松，我們的模型存在胰島素分泌過量甚至胰島素抵抗[6]，后者可影響1α-腎羥化酶的活性，影響腎臟對鈣、磷的調節，鈣流失增多,以及繼發甲狀旁腺激素等激素分泌異常，進而影響骨代謝[16]。另外，我們的結果顯示血清游離脂肪酸和甘油三酯水平亦升高明顯，后者進一步加重胰島素抵抗，負面調控骨代謝。

本研究重飼后，血清TNF-α、IL-6水平顯著升高。腹部脂肪細胞不僅儲存能量，而且分泌大量的細胞因子，TNF-α、IL-6等炎性物質使組織處于一種“慢性炎癥”環境中，在這一環境中，RANKL作為腫瘤壞死因子超家族的成員被明顯上調，它在破骨細胞前體向破骨細胞的分化中起著關鍵作用[17]，從而促進骨吸收。需要提出的是，熱卡限制期間，炎癥因子與骨密度呈相同的變化趨勢，我們推測限食期間營養底物供應不足，軀干脂肪含量變化不明顯，故炎癥因子分泌較少，同時熱卡限制導致機體能量優先供應重要臟器，骨生成受抑。

相對于RN組，RH組炎癥因子以及FISN、FFA、TG升高趨勢更為明顯，考慮與RH組軀干部位堆積了更多的脂肪，進而胰島素抵抗、脂代謝紊亂、炎癥因子釋放程度較RN組更為顯著，故對骨代謝影響更為明顯，導致血清堿性磷酸酶、骨鈣素水平下降顯著，后二者在骨骼發育與重建的過程中起重要作用[18]。

綜上所述，限食后重飼可以導致軀干部脂質含量及與全身脂肪比例增加，以高脂飲食重飼為著；熱卡限制導致骨密度下降明顯，高脂飲食重飼較正常飲食重飼骨密度恢復程度差；軀干脂肪含量及比例增加導致的高胰島素血癥、脂質外溢、炎癥因子分泌增多，進而影響骨轉換，可能是降低全身骨密度的重要原因。