SERPINE1在結直腸癌中的表達及其預后意義

馬靖宇，朱玉峰，白 光

(錦州醫科大學附屬第一醫院普外科，遼寧 錦州 121000)

結直腸癌已成為近幾十年來最常見的癌癥之一。它已成為全球第四大致命癌癥。由于生活方式和飲食行為的變化，結直腸癌的發病率在中國迅速增長，2012年全世界診斷出大腸癌136萬例，中國確診25.3萬例(占18.6%)，中國是世界上結直腸癌新病例最多的國家，大腸癌已成為中國居民健康的嚴重威脅[1]。手術是非轉移性結直腸癌患者的主要治療方法。盡管治療取得了重大進展，但結直腸癌的病死率仍然很高，并且有40%～50%的患者最終因疾病而死亡[2]。結直腸癌的早期診斷尤為重要。但是，由于早期結直腸癌患者缺乏特定癥狀，而且大多數地區尚未完成對結直腸癌的篩查，因此很難及早診斷。發現時超過60%的結直腸癌病例已經發展到晚期，且大多已轉移，存活率為8%～9%[3]。因此，開發無創且準確的篩查工具以促進結直腸癌的早期檢測和精確分期非常重要。迄今為止，基因組學的生物標志物被認為是一種有前途的方法，可以發現潛在的生物標志物來監測腫瘤的發生、發展和預后，從而進一步確保所有患者都得到適當的治療。這項研究利用生物信息學分析確定了一個具有潛在臨床應用價值的靶基因，結合組織芯片和免疫組化技術，比較靶基因在結直腸癌組織和正常結直腸組織中的表達情況，并評估靶基因在結直腸癌患者中的預后意義。

1 資料與方法

1.1一般資料 本研究共選取了2015年1月1日—2019年1月31日期間在錦州醫科大學附屬一院普外科因原發性結直腸癌接受手術治療的230例病例的結直腸癌組織和相鄰的癌旁組織。所有患者術前未接受化療和/或放療，術后生存超過30 d，且癌癥是直接的死亡原因，均接受了門診或電話隨訪，可獲得完整的隨訪數據。中位隨訪時間為735.5 d。根據第七版AJCC TNM分期系統對腫瘤分期進行分類。該研究得到了錦州醫科大學倫理委員會的批準且所有患者均簽署了知情同意書。使用福爾馬林固定石蠟包埋的組織切片的供體組織塊制備人結直腸癌組織微陣列。

1.2方法

1.2.1GEO數據集的選擇 選擇GEO數據庫中的四個數據集(GSE113513，GSE32323，GSE75548和GSE25071)合并了134個樣本的數據，并進行分析識別出總共89個差異表達基因(DEGs)(|logFold2 change|≥ 1且P<0.05)。本研究數據的篩選條件如下：①以人類與結直腸癌作為關鍵詞；②數據集為全基因組RNA表達譜數據；③僅包括結直腸癌組織和配對的癌旁組織的全基因組微陣列，并且樣本量均>10。④基因組微陣列僅使用細胞系，并分析了不同的組織學亞型，但不包括非癌性組織。

1.2.2生物信息學分析 蛋白互相作用(protein-protein interaction,PPI)網絡分析是使用檢索相互作用基因的搜索工具(STRING)進行的，并根據官方指南通過Cytoscape軟件進行可視化[4]。使用Oncolnc工具在線評估候選基因的表達與結直腸癌預后之間的相關性。從癌基因組圖譜(The Cancer Genome Atlas，TCGA)中獲得結直腸癌患者的臨床資料并通過基因表達增強交互式分析(GEPIA)確定驗證靶基因的表達水平。使用GSEA工具在基因本體論的生物學過程中進行了富集分析，選取靶基因顯著相關通路，以闡明靶基因表達對結直腸癌生物學途徑和過程的影響[5]。納入標準為P<0.05和FDR q<0.05。

1.2.3模具蠟塊的制作 在模具蠟塊上打出間距為0.1 mm，直徑為0.6 mm的小孔，樣本蠟塊根據HE染色觀察選定并分別在HE染色切片和相應石蠟組織塊標記取樣組織位點，用內徑0.6 mm的不銹鋼針進行穿刺，深度為2～3 mm，然后將其固定于模具蠟塊的小孔內，將模具蠟塊以4 μm厚度切片敷貼于載玻片上，制成組織微陣列。制備好的組織微陣列用于后續的免疫組織化學分析。

1.2.4免疫組織化學 免疫組織化學染色根據制造商提供的方法用含有10%正常血清和1%牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)的三乙醇胺緩沖鹽水溶液(tris buffered saline,TBS)溶液封閉2 h后，將組織微陣列與SERPINE1一抗(1∶200稀釋，ab125687，Abcam，中國)在4℃孵育過夜，并進行第二次標記，抗體在室溫下放置1 h。液體DAB底物在室溫下染色10 min。在顯微鏡下觀察標記細胞的信號，并由兩名對研究的臨床病理因素不知情的獨立研究人員進行評估。根據視覺免疫反應評分(immunoreacetive，IRS)=染色強度(IS)乘以陽性面積(AP)來判斷結果。IS分為：0(負)，1(弱)，2(中)和3(強)。AP取決于陽性細胞的百分比：0(0)，1(<1/3)，2(1/3～2/3)，3(≥2/3)。IRS 0～1為“-”，IRS 2～3為“ +”，IRS 4～6為“ ++”，IRS 6～9為“ +++”。因此，SERPINE1的表達分為兩類：高水平(IRS 4～9)和低水平(IRS 0～3)。

1.3統計學方法 應用SPSS 22.0統計軟件分析數據。通過Pearson卡方檢驗評估SERPINE1的表達與臨床病理參數之間的相關性。使用Cox風險回歸模型通過單因素和多因素分析評估SERPINE1的表達在結直腸癌中的預后價值。通過Kaplan-Meier方法估計存活率，并通過對數秩檢驗進行比較。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1結直腸癌的生物信息學分析 在GEO數據庫中選擇了四個合格數據集GSE113513，GSE32323，GSE75548和GSE25071，并在重疊部分中鑒定了89個差異表達基因，見圖1。使用STRING在線數據庫分析DEGs的PPI網絡，識別結直腸癌進展中的關鍵基因及其相互作用，并使用Cytoscape軟件將其可視化，該網絡包含106個節點和466個邊緣，見圖2。選擇MOCE插件來完成PPI網絡的k核分析并將k-core閾值設置為2，總共獲得了A、B和C三個模塊，它們的節點數分別為15、16和9。在這三個模塊中，節點度最高的五個基因是CCNB1、RFC2、EXOSC5、P2RY14和SERPINE1。為了研究這五個候選基因是否與結直腸癌患者的生存相關，使用Oncolnc工具在線分析了來自TCGA數據庫的結直腸癌患者的基因表達數據和臨床數據。根據Kaplan-Meier生存分析，見圖3，高CCNB1水平與更好的總體生存率顯著相關(logrankP=0.013 7)，而低SERPINE1水平與更好的總體生存率顯著相關(logrankP=0.032 5)，表明CCNB1和SERPINE1表達可能與結直腸癌的進展有關。但是在RFC2、EXOSC5和P2RY14中沒有發現類似的結果。選擇癌基因數據庫分析發現在結直腸癌組織中SERPINE1的表達增加，見圖4。使用TCGA進行了基因集富集分析(GSEA)鑒定SERPINE1基因的潛在功能。在GSEA分析中，與癌癥相關的信號通路包括通過核轉錄因子κB的腫瘤壞死因子α信號(NES=1.84)和WNT BETA CATENIN信號(NES=1.84)在 SERPINE1的高表達水平樣本中最常見(P<0.05，FDR q<0.05)，并且SERPINE1表達較高的樣本中血管生成(NES=1.94)和炎癥反應(NES=2.10)的基因特征比SERPINE1表達較低的樣本更活躍(P<0.05，FDR q<0.05)，見圖5。這表明SERPINE1可能通過參與結直腸癌患者的幾種癌癥相關信號通路來促進疾病進展。

圖1 差異表達基因的維恩圖

圖2 DEGs的PPI網絡分析

Figure 3 Draw the overall survival map of candidate genes from Oncolnc database

圖4 SERPINE1在大腸癌和正常組織中的表達差異

圖5 基因集富集分析

2.2SERPINE1基因在結直腸癌中高表達 應用免疫組織化學技術分析了包括230例大腸癌組織在內的組織芯片來研究SERPINE1在結直腸癌中的表達。SERPINE1的陽性染色主要分布在結直腸癌組織的細胞質中。在結直腸癌組織和正常組織中SERPINE1的代表性免疫組織化學染色。免疫組織化學結果顯示，在230例大腸癌中，有134個(58.3%)結直腸癌組織中SERPINE1的表達較高，而其他96例(41.7%)則較低。統計分析表明，SERPINE1蛋白在結直腸癌組織中的表達水平明顯高于癌旁正常組織。見圖6。

圖6 在結直腸癌樣品和相應正常組織中SERPINE1表達的代表性免疫組織化學圖像(免疫酶標法 ×200)

2.3結直腸癌SERPINE1表達與臨床病理參數的關系 SERPINE1的表達在不同浸潤深度、有無淋巴結轉移、有無遠處轉移和不同TNM分期組間差異有統計學意義(P<0.05)。在性別、年齡、腫瘤大小、腫瘤部位、分化和組織學類型上差異無統計學意義(P>0.05)，見表1。

表1 結直腸癌患者SERPINE1表達與臨床參數的相關性

2.4SERPINE1的高表達預示結直腸癌患者的預后不良 以大腸癌患者預后為因變量，以SERPINE1表達、性別、年齡、腫瘤大小、腫瘤位置、分化程度、組織學類型、T分期、N分期、M分期、TNM分期為自變量，采用單因素分析，結果顯示浸潤深度(P=0.035)，淋巴結轉移(P=0.001)，遠處轉移(P=0.015)，TNM分期(P=0.001)和SERPINE1表達(P=0.002)對整體生存有重大影響，見表2，3。以大腸癌患者預后為因變量，以SERPINE1表達、T分期、N分期、M分期、TNM分期為自變量，采用多因素分析，結果顯示SERPINE1表達是結直腸癌患者的獨立預后因素(P=0.020)，見表2，4。通過Kaplan-Meier生存分析評估總體生存率(overall surviva,OS)，并通過對數秩檢驗進行比較，顯示SERPINE1表達高的患者比SERPINE1表達低的患者的OS差(P=0.002)。見圖7。

表2 變量賦值表

表3 單因素Cox回歸分析結果

表4 多因素Cox回歸分析結果

圖7 結直腸癌患者不同SERPINE1表達的總體生存分析

3 討 論

利用生物信息學方法篩選出CCNB1和SERPINE1表達可能與結直腸癌的進展有關。已有研究表明，CCNB1在結直腸癌發展的早期階段過表達并促進細胞增殖，而且結直腸癌中CCNB1的過表達與淋巴結轉移、遠處轉移、TNM分期和不良生存率呈負相關[6-7]。但尚未發現關于SERPINE1表達在大腸癌中意義的研究。Serpin家族E成員1(SERPINE1)，也稱為纖溶酶原激活物抑制劑1。許多研究表明，SERPINE1在各種癌癥的多步過程中起著至關重要的作用。此外，有幾項基因表達研究已將SERPINE1鑒定為與轉移相關的重要基因。Pavon等[8]報道，在頭頸癌中，SERPINE1的過表達促進腫瘤細胞遷移和轉移擴散，促進血管生成，保護細胞免受Fas/Fas-L介導的細胞凋亡，并與不良預后相關。Liao等[9]證明胃癌組織中SERPINE1明顯上調，而且SERPINE1高表達與不良生存相。Wu等[10]報道神經膠質瘤中過表達的SERPINE1誘導了細胞凋亡，SERPINE1的作用可能基于調節p53信號通路。SERPINE1在多種腫瘤中起作用。然而，SERPINE1在大腸癌中的異常表達及其臨床意義尚未在大規模臨床樣品中得到證實。在這項研究中，我們通過生物信息學和免疫組織化學證實了SERPINE1在大腸癌患者中的臨床意義。與正常組織相比，SERPINE1在結直腸癌患者中顯著上調。另外，SERPINE1的高表達與結直腸癌的浸潤深度，淋巴結轉移，遠處轉移和TNM分期顯著相關。Kaplan-Meier生存分析表明，SERPINE1高表達的患者比低表達的患者的生存時間明顯縮短。Cox多因素分析表明，SERPINE1的高表達是結直腸癌患者預后的獨立危險因素。因此，可確定SERPINE1的高表達增加了轉移的風險，并且為預后不良的標志。

SERPINE1是尿激酶和組織型纖溶酶原激活劑的關鍵調節劑。尿激酶纖溶酶原激活物(urokinase-type plasminogen activator，uPA)系統在腫瘤生長，血管生成，腫瘤細胞入侵，遷移和轉移中起主要作用[11]。uPA系統通過激活基質金屬蛋白酶(matrix metallo proteinase，MMP)和潛在的生長因子來調節腫瘤血管生成和運動[12]。GSEA分析表明，在SERPINE1高表達的結直腸癌樣本中，血管生成尤其顯著，這表明SERPINE1基因可能通過調節uPA來調節腫瘤血管生成，從而有助于癌癥的發展。在結直腸癌中，β-catenin途徑的激活有助于uPA的反式激活[13]。通過多種癌基因的轉錄激活，WNT/β-catenin途徑被認為是癌癥的關鍵調節因子[14]。同時，在此研究中，GSEA分析表明，在SERPINE1高表達的結直腸癌組織中，與Wnt/β-catenin途徑相關的基因豐富，這表明SERPINE1可能通過Wnt/β-catenin途徑參與結直腸癌的發生發展。

結合免疫組織化學結果和生存分析，推測SERPINE1可能在結直腸癌的侵襲和轉移中起重要作用。GSEA分析表明，結直腸癌患者中炎癥反應與SERPINE1的高表達密切相關。炎癥反應在腫瘤的發生，發展和轉移中起關鍵作用[15]。炎癥浸潤產生的活性氧被認為是異常增生的原因，活性氧會導致細胞損傷，從而導致癌癥[16]。腫瘤浸潤的骨髓細胞和淋巴細胞產生炎性細胞因子，例如腫瘤壞死因子，它激活髓樣細胞中的核轉錄因子κB并刺激腫瘤相關的炎癥，腫瘤壞死因子激活轉化后的結腸上皮細胞中的核轉錄因子κB信號傳導并促進其存活和增殖[17]。同時，在該研究中，GSEA分析表明與核轉錄因子κB的腫瘤壞死因子α信號相關的基因在高表達SERPINE1的結直腸癌樣本中富集。以上所有結果提示SERPINE1可能參與了結直腸癌的發生發展，并可能通過參與腫瘤壞死因子α信號通路和Wnt信號通路而影響結直腸癌的預后。因此，深入研究結直腸癌中SERPINE1和SERPINE1途徑之間的關系將有助于結直腸癌的研究。

綜上所述，本研究證實了SERPINE1在結直腸癌中的臨床意義。免疫組化結果表明，SERPINE1在結直腸癌中表達上調，SERPINE1的高表達與腫瘤的侵襲性，疾病的進展和不良的預后密切相關。生物信息學分析也支持SERPINE1的高表達參與了結直腸癌的發病機制，且預后較差。本研究為SERPINE1用作人類結直腸癌有前景的治療靶標和新的預后生物標志物提供了重要的新證據。