某地區(qū)不同食源性大腸桿菌耐藥性檢測分析

譚琳琳 孔軍

[摘要]目的：檢測分析某地區(qū)不同食源性大腸桿菌耐藥性。方法：2018年至2019年采集某地區(qū)農(nóng)貿(mào)市場、各大超市肉品、蔬菜、乳制品、即食食品樣品396份，分離出大腸桿菌陽性樣品126份，陽性率為31.8%。結(jié)果：126株大腸桿菌對四環(huán)素、氨芐西林、萘啶酮酸的耐藥性較高，分別為44.4%、39.7%、38.1%。肉品、蔬菜分離株對四環(huán)素的耐藥性較高，分別為57.1%、52.9%;乳制品分離株對氨芐西林的耐藥性較高，為26.7%;即食食品分離株對各抗生素的耐藥性最低，為0。耐藥菌株中，sul2耐藥基因檢出率最高，addB耐藥基因檢出率最低，分別為75.0%、19.2%。結(jié)論：某地區(qū)食源性大腸桿菌具有較為嚴重的多重耐藥性。

[關鍵詞]食源性大腸桿菌;耐藥性;肉品;蔬菜;乳制品;即食食品

[中圖分類號]R155.3

[文獻標識碼]A

[文章編號]2096-5249（2021）23-0205-02

大腸桿菌屬于一種條件致病菌，是食品糞便與水源污染指示菌，也是人與動物腸道共生菌，周生菌毛與鞭毛，又稱革蘭氏陰性無芽孢桿菌，一些大腸桿菌能夠?qū)⒛c毒素產(chǎn)生，引發(fā)嬰兒與幼畜嚴重腹瀉[1]。本研究檢測分析了某地區(qū)不同食源性大腸桿菌耐藥性。

1材料與方法

1.1材料（1）菌株：2018年至2019年采集某地區(qū)農(nóng)貿(mào)市場、各大超市肉品、蔬菜、乳制品、即食食品樣品396份，分離出大腸桿菌陽性樣品126份，陽性率為31.8%。（2）藥敏紙片和培養(yǎng)基：慶大霉素、阿米卡星、鏈霉素等氨基糖苷類，四環(huán)素等四環(huán)素類，氯霉素等氯霉素類，環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、萘啶酮酸等喹諾酮類，復方新諾明等磺胺類，氨芐西林、頭孢他啶、哌拉西林、頭孢噻肟、亞胺培南、阿莫西林等β-內(nèi)酰胺類，紅霉素等大環(huán)內(nèi)酯類，多粘菌素B等多粘菌素類;藥敏紙片：購買杭州天和微生物試劑有限公司生產(chǎn)的抗生素藥敏紙片;培養(yǎng)基：購買青島海博生物技術有限公司生產(chǎn)的MH瓊脂培養(yǎng)基、EC培養(yǎng)基、LB瓊脂培養(yǎng)基、EMB培養(yǎng)基、LST培養(yǎng)基。（3）儀器和設備：購買蘇州安泰空氣技術有限公司生產(chǎn)的SW-CJ型凈化工作臺，上海弘芯電子科技有限公司生產(chǎn)的LabTech自動高壓滅菌鍋，上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠生產(chǎn)的SPX-250B-Z型生化培養(yǎng)箱、HPX-9272MBE型電熱培養(yǎng)箱，上海領德儀器有限公司生產(chǎn)的BCD-268E型低溫冷藏箱，北京市六一儀器廠生產(chǎn)的DYY-BC型電泳儀。

1.2方法

1.2.1菌株分離在225ml0.85%生理鹽水中放入25g樣品，均質(zhì)后用移液槍將1ml均質(zhì)液吸取出來，在LST肉湯管中放置，在37°C的溫度下培養(yǎng)2d，將產(chǎn)氣的LST管挑出來，將100μl菌液吸取出來，在EC肉湯管中放置，在44°C的溫度下培養(yǎng)2d。將菌液從產(chǎn)氣EC管中挑取出來，在37°C的溫度下劃線培養(yǎng)于EMB培養(yǎng)基中18～24h，將具有金屬光澤的單一菌落挑出來。

1.2.2生化試驗與PCR檢測（1）生化試驗：采用IMVIC試驗生化鑒定大腸桿菌，包括枸櫞酸鹽試驗、甲基紅試驗、VP試驗、吲哚試驗，大腸桿菌對其結(jié)果為-、+、-、-或-、+、-、+。（2）PCR檢測：將陽性對照菌株設定為石河子大學動物科學院微生物學院實驗室提供的大腸桿菌ATCC25922，采用PCR技術對所挑選出的菌株攜帶uidA情況進行檢測。uidA基因上游引物序列為5’-CGATTCCGTTTCAGGGTT-3’，下游引物序列為5’-TTTCTGATAGGACCGAGCAT-3’，擴增片段為194bp。PCR擴增反應體系：引物F、R、10×buffer、dNTP、Taq酶、去離子水、E.coliDNA模板分別1μl、1μl、2.5μl、2μl、0.5μl、17μl、1μl，共25μl。PCR擴增條件：在94°C、94°C、60°C、72°C溫度下分別預變性、變性、退火、延伸10min、1min、1min、1min，35個循環(huán)，最后在72°C的溫度下延伸10min。

1.2.3藥敏試驗用滅菌棉簽在整個平板鋪滿稀釋好的菌液，待平板干后，用無菌鑷子在平板上貼各種藥片，將3張藥片貼在每個平板上，在37°C培養(yǎng)箱中放置貼好藥片的平板18～20h。將質(zhì)控菌株設置為大腸桿菌ATCC25922，藥敏試驗過程中運用世界衛(wèi)生組織（WHO）推薦的K-B法。對試驗均對某一抗菌藥物或抗生素敏感性及敏感程度進行判定時依據(jù)抑菌環(huán)存在情況及環(huán)的大小，對大腸桿菌對抗菌藥物或抗生素的耐藥性進行判定時依據(jù)CLSI標準。

1.2.4耐藥基因檢測PCR鑒定分離株的tetA、tetB、strA、strB、aadAla、aadB、blaTEM、floR、sul2等9種耐藥基因。基因比對時依據(jù)GenBank及文獻上公布的序列，將9種耐藥基因相關引物設計出來。耐藥基因的PCR引物序列：tetA、tetB、strA、strB、aadA1a、aadB、blaTEM、floR、sul2的上游引物分別為5’-GCTACATCCTGCTTGCCTTC-3’、5’-TTGGTTAGGGGCAAGTTTTG-3’、5’-CCTGGTGATAACGGCAATTC-3’、5’-ATCGTCAAGGGATTGAAACC-3’、5’-AACGACCTTTTGGAAACTTCGG-3’、5’-GGGCGCGTCATGGAGGAGTT-3’、5’-TTGGGTGCACGACTGGGT-3’、5’-CACGTTGAGCCTCTATAT-3’、5’-GCGCTCAAGGCAGATGGCATT-3’，下游引物分別為5’-CATAGATCGCCGTGAAGAGG-3’、5’-GTAATGGGCCAATAACACCG-3’、5’-CCAATCGCAGATAGAAGGC-3’、5’-GGATCGTAGAACATATTGGC-3’、5’-TTCGCTCATCGCCAGCCCAG-3’、5’-TATCGCGACCTGAAAGCGGC-3’、5’-TAATTGTTGCCGGGAAGC-3’、5’-ATGCAGAAGTAGAACGCG-3’、5’-GCGTTTGATACCGGCACCCGT-3’，擴增片段分別為210bp、659bp、546bp、509bp、352bp、329bp、503bp、868bp、285bp。

2結(jié)果

2.1不同來源大腸桿菌的耐藥性分析126株大腸桿菌對四環(huán)素、氨芐西林、萘啶酮酸的耐藥性較高，分別為44.4%、39.7%、38.1%。肉品、蔬菜分離株對四環(huán)素的耐藥性較高，分別為57.1%、52.9%;乳制品分離株對氨芐西林的耐藥性較高，為26.7%;即食食品分離株對各抗生素的耐藥性最低，為0。見表1。

2.2PCR檢測結(jié)果分析耐藥菌株中，sul2耐藥基因檢出率最高，addB耐藥基因檢出率最低，分別為75.0%、19.2%。見表2。

3討論

本研究結(jié)果表明，126株大腸桿菌對四環(huán)素、氨芐西林、萘啶酮酸的耐藥性較高，分別為44.4%、39.7%、38.1%。肉品、蔬菜分離株對四環(huán)素的耐藥性較高，分別為57.1%、52.9%;乳制品分離株對氨芐西林的耐藥性較高，為26.7%;即食食品分離株對各抗生素的耐藥性最低，為0。耐藥菌株中，sul2耐藥基因檢出率最高，addB耐藥基因檢出率最低，分別為75.0%、19.2%，說明大腸桿菌作為一種耐藥指示菌作用極好，研究食物中的大腸桿菌能夠?qū)κ称肺⑸镲L險評估進行完善，從而對有害大腸桿菌數(shù)量進行控制。將大腸桿菌的藥敏特性、流行病學數(shù)據(jù)收集起來，將食源性大腸桿菌溯源分析數(shù)據(jù)庫建立起來能夠?qū)⒖茖W依據(jù)提供給對耐藥性流行規(guī)律的了解、對耐藥性發(fā)展趨勢的預測[2]。

綜上所述，某地區(qū)食源性大腸桿菌具有較為嚴重的多重耐藥性，值得臨床充分重視。

參考文獻

[1]張裕祥，姜雯，梁靜，等.2017-2019年新疆烏魯木齊地區(qū)急性感染性腹瀉常見病原菌分布及其耐藥性分析[J].實用藥物與臨床，2020，23（7）：641-645.

[2]李穗霞，席美麗，王盼盼，等.8省市雞肉源性大腸桿菌分離鑒定及其耐藥性檢測[J].中國人獸共患病學報，2018，34（2）：158-164.