構建基于全基因組數據的結核病耐藥及傳播監測網絡

楊婷婷 高謙

結核病耐藥監測可以了解患者中結核病耐藥的程度、范圍，揭示耐藥變化趨勢和耐藥產生的影響因素。結核病傳播監測則可以分析結核病近期傳播的動態變化，揭示傳播控制重點地區和人群，鑒定結核病的暴發事件，并對特定結核分枝桿菌流行菌株進行傳播溯源等。結核病耐藥與傳播監測將為制定精準防控策略和合理分配衛生資源提供決策依據。筆者就構建基于結核分枝桿菌全基因組測序(whole genome sequencing，WGS)數據的結核病耐藥及傳播監測網絡提出以下拙見。

一、我國結核病耐藥及傳播監測現狀

我國現行結核病監測體系包含結核病疫情監測和耐藥監測。結核病疫情監測主要是通過傳染病直報和專報系統，實時掌握全國結核病疑似患者和活動性結核病患者的情況，包括流動人口和結核分枝桿菌與HIV雙重感染者。通過結核病患者個案信息網絡電子化管理，現有監測體系能夠實時了解并評價各地患者發現、治療管理和規劃活動的進展[1-2]。2007—2008年，我國采用分層整群抽樣的方法，隨機抽取全國31個省份(中國香港、澳門和臺灣除外)共70個縣(區)，首次組織了全國結核病耐藥性基線調查工作[3]；從2015年開始，國家結核病參比實驗室利用31個省的72個區縣級結核病防治機構連續進行全國性結核病耐藥性監測工作，并計劃在此基礎上建立覆蓋288個監測點、區、縣的結核病耐藥監測網絡[4]。

但是，我國目前的耐藥監測體系在樣本量和檢測方法上仍存在一些問題。耐藥監測主要基于抽樣樣本，目前每年約4000多株菌株，很難代表全國耐藥現狀。另外，采用表型藥物敏感性試驗(簡稱“表型藥敏試驗”)檢測方法，存在樣本轉運困難、測試時間長、生物安全要求高、工作量大、不同實驗室之間質量控制困難等問題[5]。

我國目前還幾乎沒有開展結核病傳播監測工作，只有少部分地區利用數目可變串聯重復序列(variable number of tandem repeats，VNTR)、IS6110和間隔區寡核苷酸分型(spacer oligonucleo-tide typing，Spoligotyping)等基因分型技術對收集的少量菌株進行分析。筆者在全國的幾個研究現場開展了連續多年的基于VNTR分型的流行病學研究[6]，近年來也利用結核分枝桿菌WGS數據分析了這些現場結核病的傳播規律[7-8]。但這些分子流行病學方法的應用目前僅停留在研究層面，并沒有真正發揮監測作用。

二、基于WGS數據的結核病監測網絡優勢及國外現狀

結核分枝桿菌WGS在結核病耐藥和傳播監測方面具有很大的優勢。基于WGS預測的分子藥敏與表型藥敏試驗檢測結果相比，更加快速、全面、簡便和穩定[9-10]。盡管目前分子藥敏結果與表型藥敏試驗檢測結果還不完全一致(特別是對一些二線抗結核藥物)[11-12]，但作為耐藥監測，只要采用相同的方法是可以反映耐藥變化趨勢的；同時，耐藥監測對檢測結果的反饋時間要求比臨床診斷寬松，可以集中樣本統一送樣測序以降低成本，其費用低于表型藥敏試驗檢測。

基于WGS的基因型分析比傳統基因型分型技術(IS6110-RFLP、Spoligotyping和MIRU-VNTR等)具有更高分辨率，能夠更準確地追蹤特定菌株的傳播和鑒定暴發事件[13]，為流行病學調查提供更可靠的線索[14]；WGS數據與患者流行病學數據結合可進一步分析傳播的危險因素等(如傳播的高危場所及人群)[8]；長期監測代表一個地區結核病近期傳播的成簇率動態變化，可以反映該地區結核病傳播控制的水平，同時可以用于評估控制策略的效果。此外，隨著測序數據的積累，可以在全省甚至全國范圍內監測伴隨人口流動的結核分枝桿菌的傳播和溯源，分析流動人口是在原籍感染還是到城市后感染發病，這對流動人口結核病防控政策的制定至關重要。

目前，英國、美國，以及歐洲一些國家已將WGS應用于結核病耐藥和傳播的監測，并取得了初步成果。英國在2017年率先宣布對英格蘭(西歐結核病發病率最高的地區之一)的所有結核分枝桿菌菌株進行WGS，其結果用于結核病診斷、耐藥性檢測和菌株分型[15]。美國從2012年開始逐步推進使用WGS替代VNTR鑒定傳播或暴發，并計劃在2021年全部使用WGS進行成簇菌株鑒定[16]。自2015年以來，歐洲疾病預防控制中心(European Centre for Disease Prevention and Control，ECDC)一直支持將WGS應用于公共衛生預防的多試點研究和項目[17]。WGS的應用提高了英國的耐藥檢測速度，并提供了對結核病傳播的準確判斷以支持相關部門對成簇病例的調查[18]。EUSeqMyTB聯盟[19]進行的一項分子流行病學研究表明，基于WGS的傳播監測可以有效地顯示歐盟(European Union，EU)或歐洲經濟區(European Economic Area，EEA)國家的國內和跨境耐多藥/利福平耐藥結核病(MDR/RR-TB)傳播情況[20]。隨著WGS的成本不斷下降，預計將有更多的國家把其納入結核病監測規劃。

三、SAM-TB平臺的建立解決了測序數據分析瓶頸

對WGS產生的大量數據進行分析和解釋是目前該方法應用的主要瓶頸之一[21]。WGS的常規分析流程及其產生數據的管理需要專門的生物信息學團隊和高性能的服務器，而目前國內大多數結核病實驗室尚不具備。同時，WGS數據分析目前仍缺乏一致的、國際公認的標準流程，不同的分析流程輸出的單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism，SNP)數量和類型存在差異，對分析結果進行交叉比較和驗證存在困難[22]。不同分析流程得到的結果不適合直接整合用于鑒定基因組簇(傳播或暴發事件)[23]。因此，目前雖然已有多種分析工具可以進行結核分枝桿菌耐藥預測和傳播鑒定，但不同軟件得到的結果難以直接整合。

為克服上述瓶頸，筆者與深圳市慢性病防治中心合作，建立了一個界面友好、操作簡單、功能豐富的中英文結核分枝桿菌WGS分析平臺——SAM-TB (http://samtb.szmbzx.com)。該平臺基于Illumina測序獲得的paired-end序列，對結核分枝桿菌樣本進行全基因組變異(包括SNP和indel)分析和耐藥突變鑒定，可以準確預測菌株對17種抗結核藥品(異煙肼、利福平、乙胺丁醇、吡嗪酰胺、乙硫異煙胺、氧氟沙星、莫西沙星、鏈霉素、卡那霉素、阿米卡星、卷曲霉素、對氨基水楊酸、環絲氨酸、利奈唑胺、氯法齊明、貝達喹啉和德拉馬尼)的耐藥性以及對4種一線抗結核藥品的敏感性[24]；通過重建系統發育樹和計算菌株間SNP距離分析菌株之間的遺傳關系，鑒定代表近期傳播的簇菌株；還可以鑒定非結核分枝桿菌(nontuberculous mycobacteria，NTM)不同菌種，檢測結核分枝桿菌和NTM混合樣本。同時，該平臺支持樣本數據的批量上傳、批量分析和分析結果的批量導出，方便國內外同道的使用。

四、建立基于WGS的結核病耐藥和傳播監測數據庫

目前，在我國建立基于結核分枝桿菌WGS的結核病耐藥和傳播監測網絡的條件已經成熟。首先，按照中國疾病預防控制中心要求，區縣級結核病實驗室都具備開展痰培養的能力，痰培養陽性菌株數量將越來越多。其次，國內相關企業的測序能力較強，測序方便、簡單，只需將培養陽性菌株滅活后送往公司，公司提供菌株DNA提取、建庫、測序服務，總費用在350元左右，并且價格還將下降。第三，SAM-TB數據分析平臺的建立，使測序數據的分析統一、簡便。因此，筆者建議應該盡快建立結核分枝桿菌臨床菌株WGS數據庫，數據庫中包括結核分枝桿菌測序數據和與菌株對應的來自國家結核病專報系統的患者基本信息。同時，數據庫具備數據統計分析及圖形化展示功能，可以實時顯示菌株對所有抗結核藥物的耐藥水平、變化趨勢，以及結核分枝桿菌近期傳播患者的分布和傳播的熱點區域，實現對結核病耐藥和傳播的監測。現階段可以先建立省、市級的監測數據庫，監測本省、市內結核病的耐藥與傳播。由于各省、市采用統一的數據來源(結核病專報網數據)和測序數據分析平臺，待時機成熟即可較為容易實現全國數據共享，建成全國結核病耐藥和傳播監測網絡。

五、因省制宜，逐步推進培陽菌株測序，發揮WGS監測網絡優勢

結核病耐藥和傳播監測網絡是一個逐步建立的過程，數據積累越多，其作用就越大，但必須現在開始起步。考慮到各省、市經濟水平的差異，筆者建議目前可以先將醫療機構培養陽性的菌株滅活后送省級機構統一保管(比運送和保存活菌簡單、方便、安全)，根據經費狀況將部分或全部滅活菌株交測序企業，由其負責DNA提取、建庫、上機測序，最后提供質量可靠的測序數據。

另外，目前很多單位都在建立菌株樣本庫，有些單位也已經保留了很多菌株樣本。由于活菌標本的保存、運送對生物安全的要求高，還需要大量的-80 ℃冰箱。因此，建議除非有明確的目的和完善的臨床研究設計方案，才有必要和價值建立樣本庫。否則，筆者建議將所有菌株測序，建立數字菌株庫，這樣完全能夠滿足結核病耐藥和傳播監測及常規的研究需要。如暫時沒有經費測序，則建議保留滅活的菌株，待有條件再行測序。

六、結語

隨著我國結核病患者的痰培養的比例提高、WGS的成本快速下降，以及SAM-TB測序數據分析平臺的建立，在我國建立基于WGS的結核病耐藥和傳播監測網絡已經成為可能。以各省為單位逐步推進結核病耐藥和傳播監測網絡的建設，實現實時監測耐藥結核病的變化趨勢、追蹤結核病的傳播與暴發，以提高我國結核病控制水平，刻不容緩。