PM2.5對皮膚角質形成細胞的影響

李錦濯 林志鵬 曾倩雯 孫仁山

陸軍軍醫大學大坪醫院皮膚科,重慶,400042

隨著我國城市化及工業的快速發展，空氣污染較嚴重。室外空氣污染物的主要成分是顆粒物(particulate matter, PM)、臭氧、二氧化氮、二氧化硫和一氧化碳。其中顆粒物對健康的危害引起了廣泛關注，根據顆粒物的空氣動力學直徑分為PM10、細顆粒物和超細顆粒物，細顆粒物是直徑≤2.5 μm的顆粒物(PM2.5)，研究認為，顆粒物粒徑越小，危害越大，PM2.5對人體健康的危害程度比較大顆粒物更嚴重[1]。

PM2.5主要來源為化學燃料的燃燒，生產生活排放的煙塵，各類交通工具的尾氣以及自然揚塵等。PM2.5組成十分復雜，主要包括元素碳、多環芳烴等有機化合物、多種無機鹽、重金屬元素及混雜的生物物質等成分[2]。許多流行病學研究表明，環境PM2.5濃度增加與心血管系統和呼吸系統疾病的發病率及死亡率密切相關[3,4]。皮膚是抵御環境污染物的重要防御屏障，皮膚長期暴露在空氣污染物中，PM2.5攜帶的有機化合物如多環芳烴(polynuclear aromatic hydrocarbon, PAH)等成分具有高度親脂性，容易滲透進入皮膚[5]。經皮滲透性與屏障的完整性、解剖部位、年齡和污染物性質顯著相關，這些被吸收的物質可引起皮膚損傷。越來越多的證據表明PM2.5與特應性皮炎、痤瘡、濕疹、銀屑病等炎癥性皮膚病以及皮膚老化等多種皮膚病具有相關性[6]。目前研究認為，空氣污染導致皮膚損傷的可能機制有四種：(1)活性氧自由基的生成;(2)炎癥級聯反應的誘導;(3)皮膚屏障的損傷;(4)芳烴受體(aryl hydrocarbon receptor, AHR)的激活[7]。角質形成細胞是皮膚表皮層的主要細胞，與外界刺激物直接接觸。角質形成細胞是PM2.5作用于皮膚的主要靶細胞之一，當人體長時間暴露在 PM2.5的環境下，角質形成細胞受到損傷，可能增加多種皮膚病的發病率。為探討 PM2.5對皮膚角質形成細胞的生物學效應，本文綜述了PM2.5與皮膚病的關系以及PM2.5對皮膚角質形成細胞增殖活性、細胞凋亡、細胞自噬、芳香烴受體激活、氧化應激以及炎性反應等方面的影響。

1 PM2.5與皮膚病的流行病學研究

流行病學研究報道PM2.5可以增加特應性皮炎、痤瘡、濕疹、皮膚腫瘤等皮膚病以及皮膚老化發生的風險。Kim等[8]基于廣義線性混合模型的研究表明，隨著PM2.5和PM10暴露量的增加，特應性皮炎(atopic dermatitis, AD)癥狀顯著加重。

Le等[9]Meta分析結果表明，PM與AD、濕疹和皮膚過敏密切相關，PM10和PM2.5與AD的風險增加均有關，但PM2.5體積較小，含有重金屬成分較多，容易滲透到皮膚細胞，更容易引發AD，因此與PM10相比，PM2.5和空氣顆粒物污染相關皮膚病之間的關系更密切，具有更高的風險。研究發現暴露于空氣污染物可以加重尋常痤瘡的癥狀[10]。研究認為部分青春期后痤瘡與環境污染相關，如氯痤瘡與接觸二噁英或其他氯化烴類污染物密切相關[11]。有研究對北京市大氣污染與門診尋常痤瘡患者數量進行相關性分析，發現環境PM2.5濃度與尋常痤瘡患者就診數量顯著相關，為尋常痤瘡與空氣污染之間的關系提供了間接證據[12]。研究表明，暴露于PM2.5可加重兒童過敏性皮炎和濕疹的癥狀[13]。研究表明，空氣污染成分，特別是PM、PAH和臭氧，可以導致皮膚過早老化，皺紋的出現[14]。Peng等[15]研究納入400名年齡在40～90歲的女性，分析PM2.5濃度高低對皮膚老化的影響，發現PM2.5濃度較高地區與PM2.5濃度較低地區的人群相比，面頰部和手背部的老年色斑數量分別高出1.48倍和2.8倍，高濃度PM2.5暴露與皮膚老化顯著相關。此外，研究顯示PM是皮膚腫瘤尤其是黑色素瘤的高危因素[16]。然而，目前關于PM2.5對皮膚損傷的具體機制研究仍然有限，國內外學者多選用人永生化角質形成細胞(HaCaT細胞株)作為體外實驗研究對象來研究 PM2.5 對皮膚損傷的相關機制。

2 PM2.5對角質形成細胞的影響

2.1 PM2.5對角質形成細胞增殖、自噬、凋亡的影響 研究表明，多環芳烴類為主的有機物、各種重金屬元素及病原微生物可能是PM2.5主要毒性成分，可降低細胞存活率并對細胞自噬、凋亡等產生影響。薛晨紅等[17]采集北京市霧霾天氣PM2.5刺激HaCaT細胞，發現隨著PM2.5濃度升高，200～800 mg/L組HaCaT細胞形態發生改變，漂浮死亡細胞逐漸增多；與對照組相比，100～400 mg/L組細胞存活率降低，凋亡率升高，差異有統計學意義(P<0.05)，說明PM2.5可抑制細胞增殖，并促進細胞凋亡，其機制可能是通過下調細胞周期蛋白A2(cyclin A2)、細胞周期蛋白依賴性激酶1(cyclin-dependent kinases1, CDK1)蛋白的表達來誘導S期阻滯。盛晚香等[18]研究發現經PM2.5染毒后HaCaT細胞內自噬標志蛋白微管相關蛋白1輕鏈3(microtubule-associated protein 1 light chain3, LC3)表達高于對照組，且呈濃度依賴性升高，表明PM2.5誘導角質形成細胞發生自噬，可能是細胞對抗氧化應激損傷及細胞凋亡的一種自我保護反應。Hu等[19]研究表明，隨著PM2.5刺激濃度增高，HaCaT細胞存活率降低，同時伴隨著細胞培養上清液中乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase, LDH)的釋放顯著增加，表明細胞膜完整性的喪失和通透性的增加，同時發現PM2.5導致細胞內DNA損傷并誘導細胞凋亡，細胞內細胞色素C、半胱氨酸蛋白酶3(caspase3)及半胱氨酸蛋白酶9(caspase9)表達呈劑量依賴性增加，提示PM2.5通過線粒體途徑誘導細胞凋亡。

2.2 PM2.5對角質形成細胞內芳香烴受體激活的影響 研究表明PM2.5中攜帶的多種有機化合物(多環芳烴等)可以激活細胞內AHR[20]。AHR是一種配體激活的轉錄因子，作為外界環境刺激的傳感器，參與皮膚病理生理過程，皮膚細胞內AHR激活可能與皮膚色素沉著、皮膚腫瘤、炎癥性皮膚病等皮膚損害的發生發展密切相關[21]。Jang等[22]發現PM可以導致HaCaT細胞中AHR信號激活，LC3蛋白表達增多，而使用AHR抑制劑可以顯著降低LC3蛋白水平，表明PM通過AHR信號誘導HaCaT細胞自噬。Tauchi等[23]研究表明皮膚細胞內AHR通路激活會引起炎癥性皮膚損傷。Hidaka等[24]研究發現空氣污染物誘導角質形成細胞中AHR的激活和神經營養因子Artemin (ARTN)的過表達，導致特應性皮炎相關炎癥因子TSLP和IL-33表達上調，表明AHR激活可能是空氣污染引起特應性皮炎加重的機制之一。

PM2.5誘導HaCaT細胞內AHR激活可能是其引起皮膚老化的機制之一。Ryu等[25]研究表明PM2.5引起皮膚衰老的可能機制是PM2.5誘導角質形成細胞內AHR激活，導致活性氧(ROS)生成增多，進而導致衰老相關基因表達的表觀遺傳修飾。Qiao等[26]研究顯示PM2.5激活角質形成細胞內AHR，AHR通過調控絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)信號通路中的ERK/MAPKs和JNK/SPAK信號通路介導皮膚老化相關基因基質金屬蛋白酶-1(matrix metalloproteinases-1, MMP1)的表達。

PM2.5誘導HaCaT細胞內AHR激活，進而可以導致下游ROS生成增多，炎癥信號激活，皮膚屏障蛋白表達異常。Choi等[27]研究表明沙塵暴中粉塵顆粒物可以誘導角質形成細胞內AHR激活，使細胞色素p450酶如：CYP1A1、CYP1A2 和 CYP1B1 的基因轉錄增強，導致ROS和下游炎癥因子產生增多，同時影響表皮分化蛋白的異常表達，產生皮膚損傷效應。Lee等[28]研究表明PM2.5通過激活HaCaT細胞內AHR，引起ROS的生成增加，進而激活兩條MAPK信號通路：一條通過ERK/p38激活核轉錄因子κB(nuclear factor kappa-B, NF-κB)，另一條通過JNK激活轉錄因子激活蛋白1(activator protein-1, AP-1)，最終導致環氧合酶2(cyclo-oxygenase-2, COX2)和前列腺素E2(prostaglandin E2, PGE2)表達增加，而絲聚蛋白表達下調，引起皮膚屏障受損。

2.3 PM2.5對角質形成細胞氧化應激的影響 氧化應激是細胞受到外界有害因素刺激后最早出現的指標，氧化應激是由活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)的過量產生或清除不足引起的。研究認為，PM2.5誘導氧化應激是其損傷效應的一個重要機制，過多的ROS生成會導致DNA損傷和細胞內信號傳導異常，導致免疫系統失調，并誘發加重炎癥性皮膚病、皮膚老化和皮膚腫瘤等多種皮膚疾病[29]。PM2.5可以通過多種途徑導致過量的ROS產生，PM2.5表面結合的多環芳烴和醌類化合物表現出強烈的氧化還原活性[30]，可以通過氧化還原反應形成ROS。PM2.5中的金屬如鐵、銅等可以通過芬頓反應產生ROS[31]。在細胞內，PM2.5可以通過改變NAPDH氧化酶和線粒體功能誘導內源性ROS水平升高[32]，此外，如上所述，PM2.5還可以通過誘導HaCaT細胞內AHR激活，進而導致ROS產生增多。

一方面，PM2.5誘導細胞生成過量的ROS，可以損害DNA、脂質和蛋白質等生物大分子以及細胞器進而導致靶細胞損傷。Piao等[33]研究顯示PM2.5通過產生ROS引起氧化應激，導致DNA損傷、脂質過氧化和蛋白質羰基化，引起內質網應激、線粒體損傷和細胞自噬，并最終導致HaCaT細胞凋亡，而抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸(N-Acetyl-L-cysteine, NAC)可減輕PM2.5誘導的細胞損傷，證實PM2.5產生的細胞毒性是氧化應激所致。Lin等[34]研究表明PM2.5可誘導HaCaT細胞氧化應激，破壞皮膚完整性。另一方面，PM2.5不僅刺激ROS生成增加，同時還損害細胞內抗氧化反應體系，如抑制細胞內谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-Px)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)等抗氧化酶活性，降低細胞清除ROS的能力，從而使細胞處于氧化應激狀態。熊書晗等[35]研究發現PM2.5刺激HaCaT細胞后丙二醛(Malondialdehyde, MDA)含量、ROS水平顯著高于對照組，而SOD和GSH-px的活性顯著下降，表明PM2.5能夠對HaCaT細胞造成氧化應激損傷。

2.4 PM2.5對角質形成細胞炎癥反應的影響 角質形成細胞作為表皮層主要的構成細胞，通過其模式識別受體(pattern recognition receptor, PRR)轉導信號，介導一系列免疫炎癥反應，在皮膚天然免疫反應中發揮重要作用。在外界環境因素刺激下，通過產生抗菌多肽， IL-1、IL-8、IL-18、IL-6、TNF-α等細胞因子以及CCL20、CXCL9、CXCL10、CXCL11等趨化因子，進而激活或募集其他皮膚免疫細胞如樹突狀細胞、T細胞、中性粒細胞等，發揮免疫保護作用[36]。PM2.5含有PAH、重金屬、內毒素等組分，能誘導細胞產生大量炎性介質如：IL-1β、IL-8、IL-6、TNF-α等，這些炎性介質通過復雜的免疫途徑引起免疫損傷[37]，可能在皮膚炎癥性疾病的發病機制中發揮作用。Kim等[38]使用轉錄組和基因本體富集分析的新一代測序方法研究PM2.5對角質形成細胞的影響，發現炎癥因子如TNF、IL-1α等以及銀屑病相關炎癥因子如IL-17A、IL-36γ等基因表達顯著改變，同時PM2.5導致細胞內p38 MAPK信號通路及NF-κB信號通路磷酸化激活。

PM2.5對角質形成細胞炎癥反應的影響涉及多個細胞表面受體，多條細胞內炎癥信號通路。Ryu等[39]研究發現PM2.5通過TLR5-NOX4-ROS-NF-κB-IL-6通路誘導角質形成細胞炎癥反應，靶向阻斷細胞表面的TLR5-NOX4可能是減輕PM2.5炎癥損傷的一種治療策略，此外，PM2.5誘導的IL-6轉錄升高是通過表觀遺傳修飾的DNA甲基化和組蛋白甲基化來調控的。Kwon等[40]研究表明城市顆粒物可以通過NF-κB和p38 MAPK信號通路激活增加角質形成細胞表面的辣椒素受體(transient receptor potential vanilloid-1,TRPV1)表達上調，從而增加Ca2+內流水平和促炎細胞因子IL-8、TNF-α和IL-1β的表達，最終導致皮膚損傷。Zhang等[41]通過構建細胞培養芯片和蛋白質芯片相結合的微流控系統，研究PM2.5暴露對HaCaT細胞的影響，結果發現PM2.5誘導HaCaT細胞中NF-κB和核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3, NLRP3)炎癥體信號激活， IL-1β和IL-6表達上調。劉丹等[42]測定霧霾和沙塵暴兩種不同天氣下收集的PM2.5對HaCaT細胞分泌炎癥因子的影響，結果發現沙塵暴天氣PM2.5具有更強的促炎癥效應，而霧霾天氣PM2.5具有更強的致敏反應，而其致敏反應可能是通過TLR2/4等促免疫信號通路。

目前研究認為，PM2.5導致的炎癥反應主要是由氧化應激介導的。Kim等[43]研究表明PM2.5顆粒的表面反應活性可以直接產生ROS，也可以通過細胞內線粒體損傷途徑及氧化還原途徑誘導ROS的生成，而ROS可以激活下游MAPK信號通路，包括ERK1/2、JNK和p38，隨后激活NF-κB和AP-1等轉錄因子，最終導致細胞因子TNF-α、IL-1α、Il-6等表達上調。

2.5 PM2.5對角質形成細胞內皮膚屏障相關成分表達的影響 角質形成細胞中表達與皮膚屏障功能相關的成分包括絲聚蛋白、角蛋白、緊密連接蛋白及脂質成分等，這些成分的表達異常將導致皮膚屏障受損。PM2.5可能通過影響角質形成細胞內皮膚屏障相關蛋白、脂質的表達進而破壞皮膚屏障功能。Nguyen等[44]發現，HaCaT細胞暴露于PM后角蛋白16的表達下調，角蛋白16是表皮細胞增殖的標志，負責角質形成細胞的機械完整性，其表達異?？蓪е缕つw屏障受損。Kim等[38]通過分析PM2.5對角質形成細胞轉錄組的影響，發現PM2.5可誘導細胞皮膚屏障相關蛋白表達的異常，主要表現為絲聚蛋白、內披蛋白、轉谷氨酰胺酶3等表達升高及角蛋白10和15表達降低，導致皮膚屏障受損。姚騏羽等[45]發現PM2.5導致角質形成細胞內角蛋白14、絲聚蛋白和緊密連接蛋白1的表達改變，同時誘導炎癥因子IL-1α、TSLP、IL-33表達上調，在炎癥因子的協同作用下加劇皮膚屏障損傷。Liao等[46]通過對PM2.5染毒的角質形成細胞進行轉錄組分析，發現PM2.5影響膽固醇代謝相關基因表達改變，在PM2.5暴露的3D皮膚模型中，發現膽固醇升高，角鯊烯降低，而膽固醇和角鯊烯是影響皮膚屏障功能的關鍵物質，表明PM2.5可能通過影響角質形成細胞膽固醇的合成改變導致皮膚屏障受損。

2.6 PM2.5與紫外線共同作用對角質形成細胞的影響 室外空氣中PM2.5污染可以與紫外線共同作用損傷皮膚，因此，部分研究把PM2.5與紫外線聯系起來綜合考慮兩者對皮膚的生物學效應，目前已有實驗將PM2.5成分與UVB或者UVA聯合刺激角質形成細胞進行研究。Hyun等[47]研究發現，與單純的PM2.5或UVB處理相比，PM2.5和UVB的聯合處理HaCaT細胞產生更多的ROS，導致細胞內脂質過氧化、DNA氧化損傷及細胞凋亡程度更嚴重。牛夢鴿等[48]研究表明PM2.5和UVB聯合處理HaCaT細胞后細胞活力顯著低于單純的PM2.5組及UVB組，說明PM2.5與UVB聯合處理對抑制細胞活力有協同作用，且聯合處理后細胞自噬標志蛋白LC3-II表達高于單純的PM2.5組及UVB組，說明聯合作用后PM2.5誘導較強的自噬增加了UVB對HaCaT細胞的損傷。此外，研究認為PM2.5中的有機成分PAH對光敏感，可吸收UVA范圍內的光照，PHA在UVA暴露下會產生ROS，兩者協同作用損傷皮膚[49]。Soeur等[50]采用納摩爾濃度的PAH來模擬PM通過吸入后的循環途徑對皮膚的影響，發現PAH在低濃度下顯示出較高的光敏性，UVA1 聯合PAH處理角質形成細胞后，表現出顯著的協同損傷作用，與單純處理組相比，聯合處理組更加顯著的抑制了細胞增殖，增加了ROS的生成，同時觀察到細胞內線粒體膜去極化和ATP產生減少。

3 小結

綜上所述，流行病學研究顯示PM2.5與多種炎癥性皮膚病、皮膚腫瘤以及皮膚老化具有相關性?；A實驗研究表明，PM2.5可引起角質形成細胞增殖活性降低，誘導細胞自噬及細胞凋亡，同時誘導細胞內AHR激活，氧化應激狀態，炎癥級聯反應以及皮膚屏障相關成分表達改變，此外PM2.5與紫外線對角質形成細胞可能具有協同損傷作用。目前多數研究認為PM2.5對角質形成細胞的影響機制主要以氧化應激和炎癥損傷為主。PM 2.5對角質形成細胞的影響并不是單一途徑，而是多種途徑，多種機制參與的復雜過程，不同機制間存在相互聯系，相互影響，各機制之間具體是如何相互作用的目前還不是很明確。

此外，盡管不同地區的PM2.5化學組分類似，但其中各化學組分占比差異很大。主要原因是各地區排放源的不同，例如城區車輛尾氣排放、北方冬季燃料供暖、石油化工聚集區排放、工業聚集區排放及建筑區的揚塵等都會影響該區域PM2.5組成變化。最終導致不同的采樣地點和采集時間等收集的PM2.5具有成分差異，其對細胞的損傷作用及相關機制也可能不同。因此，研究PM2.5中具體哪些化學組分誘導氧化損傷及炎癥損傷對于機制研究具有重要意義?？傊?，PM2.5究竟是通過何種機制損傷角質形成細胞，進而導致皮膚相關疾病發病率增高或癥狀加重以及如何進行有效防治，還有待進一步研究。