多發性硬化代謝組學研究進展

王蒂媛 殷旭華 米飛躍

1）內蒙古醫科大學，內蒙古 呼和浩特 010058 2）內蒙古醫科大學附屬醫院，內蒙古 呼和浩特 010059

多發性硬化（multiple sclerosis，MS）被認為是中樞神經系統自身免疫介導的炎性脫髓鞘疾病，以血腦屏障破壞、軸索損傷、膠質增生、脫髓鞘為主要特征［1-2］，該病的臨床特點為時間多發性和空間多發性，可表現為反復發作的視力下降、復視、肢體感覺障礙、肢體運動障礙、共濟失調、膀胱或直腸功能障礙等。該病呈全球性分布［3］，各地發病率不同，預計全球有250萬患者，MS的發病年齡20～40歲，女性多見，是年輕患者非創傷性殘疾的首要原因，給家庭及社會帶來極大的經濟負擔［4］。

早期防治可以延緩疾病的進展，改善患者的生活質量。研究表明環境和遺傳因素會增加MS的風險［5］，但疾病的確切因素尚不清楚，使得疾病的準確診斷、預后和治療變得復雜。對MS的深入研究有助于進一步理解其病理生理特點，了解發病機制以及進一步尋找其潛在的診斷或治療靶點。代謝組學是一種高通量、高靈敏度的檢測技術，主要針對細胞、組織、體液中相對分子量＜1 000的小分子進行分析，是連接各種生物過程的代謝途徑的分支［6］。代謝組學從疾病下游小分子層面認識疾病的內在過程，能夠更直接、更準確地反映生物體的生理狀態，是轉錄組學和蛋白質組學的延伸，提供無法從基因組學、轉錄組學或蛋白質組學等其他技術獲得的信息，且其可作為一種精確的非侵入性工具辨別藥物治療的作用機制，區分遺傳學、微生物組活性和營養對整體代謝表型的貢獻，正越來越多地被用于開發疾病的生物標記物和確定致病機制等［7-9］。因此，運用代謝組學可能會為理解MS的復雜性和發病機制提供另一個見解，且有潛力成為多發性硬化診斷和治療的工具。近年來，越來越多的學者將代謝組學技術運用于MS的研究。本文總結了近年來國內外相關文獻，從發病機制、診斷、監測疾病進展、分期、鑒別其他相關疾病以及預測藥物療效等方面進行綜述。

1 代謝組學技術概述

代謝組學誕生于20世紀末，由英國倫敦帝國大學NICHOLSON教授提出［10］。目前代謝組學分析最流行的3個平臺是磁共振技術（NMR）［11］、氣相色譜-質譜法（GC-MS）［12］和液相色譜-質譜法（LC-MS）［13］。這些技術均可以高通量、自動化的方式檢測、識別和量化代謝物。磁共振在代謝物鑒定和自動化方面具有優勢，但靈敏度較低，檢測范圍局限，儀器成本稍高等缺點限制了其廣泛使用。GC-MS具有靈敏度高、儀器成本低等優點，但樣品前處理工作量較大。與前兩種比較，LC-MS應用范圍相對廣泛，可對大部分小分子代謝物進行準確、靈敏的鑒定。

非靶向和靶向性分析是代謝組學研究的兩種主要方法［14］。非靶向方法用于生成假設，能夠對生物樣品中的所有代謝物進行檢測，可以更廣泛地了解整個代謝組和相關表型，通常被認為是基于假設生成發現的模型。相反，靶向方法是通過對先前假設的測試驅動的，該假設能夠對最多20種特定但有限的代謝物進行絕對量化。兩種方法的聯合使用可以實現精確識別和完整量化。

2 代謝組學在MS中的研究

2.1診斷方面目前MS的診斷以2017年修訂的McDonald標準作為金標準［15］，強調時間和空間上的多發，但在臨床上MS常因首次發作的時間多發性和空間多發性證據不足，且診斷缺少特異性標志物，因而容易誤診和漏診。為了提高早期診斷率，人們開始思考是否存在其他的生物標志物可以提高MS的診斷。隨著代謝組學技術的發展，其逐漸應用于MS。早在1993年，LYNCH等［16］用磁共振檢測到MS患者和正常對照組腦脊液中存在差異代謝物。后又有人利用質子磁共振譜進行代謝譜分析，結果顯示與對照組相比，MS組硒含量明顯降低［17］，但當時所鑒定出來的差異代謝物數量較少。PODDIGHE等［18］采用質譜技術對16例MS患者和12名健康對照者的血漿進行代謝組學分析，發現2組天冬酰胺、鳥氨酸、谷氨酰胺和谷氨酸等代謝物存在差異，這些發現與使用磁共振方法分析腦脊液樣本的研究結果相似［19］。在一項最近的研究中，使用高分辨率混合四極桿-Orbitrap質譜儀對12個MS患者和12個健康對照者的腦脊液CSF進行分析發現，與對照組相比，MS患者的甘氨酸、不對稱二甲基精氨酸（ADMA）、甘油磷脂PC-O（34∶0）和己糖的水平顯著增加［20］。以上結果表明代謝組學是一種有效的方法，可能為該疾病提供新的生物標志物。

2.2發病機制方面目前為止，多種系統生物學方法已被應用于MS的研究，如基因組學、蛋白組學，并對該病的發病機制取得一定進展［21-24］，但關于其發病機制的看法仍不統一，所以需要更多的工具說明MS的確切發病機制。SINGH等［25］采用高效液相色譜和質譜聯用技術，在MS動物模型中發現8種常見的代謝產物在病例和對照組的血液和尿液生物液體中均發生明顯的改變，其中苯丙氨酸代謝紊亂，谷氨酰胺、亮氨酸和異亮氨酸代謝途徑紊亂，參與中樞神經系統功能障礙。VANYSLADA等［26］使用基于質譜的非靶向代謝組學研究表明，大多數改變發生在脂類、能量代謝、脂肪酸代謝和磷脂代謝水平的改變。另一項研究確定了MS病例組和對照組的12種差異代謝物，其中6種AUC>80%，如焦谷氨酸、月桂酸酯。這些代謝物參與谷胱甘肽代謝、脂肪酸代謝/氧化、細胞膜組成和瞬時受體電位通道信號傳導。基于每種代謝物的基因表達關聯的途徑分析表明，與細胞凋亡和線粒體功能障礙有關的途徑富集。有趣的是，主要的MS遺傳風險等位基因HLA-DRB1×15：01與6種最相關代謝物之一相關［27］。以上研究表明能量代謝、脂代謝、氧化應激等可能參與MS的發病機制。

2.3疾病分期或進展方面NOGA等［28］使用靶向液相-色譜質譜法（LC-MS）和氣相-色譜質譜法（GCMS）研究了急性實驗性自身免疫性腦脊髓炎（EAE）大鼠模型中的CSF代謝組，通過同時注射兩種不同物質誘導大鼠急性EAE。在兩個時間點收集CSF樣品：接種后10 d（在疾病發作期間）和接種后14 d（在疾病高峰期）。與對照相比，EAE發作期間代謝組圖譜顯示精氨酸、丙氨酸和支鏈氨基酸水平顯著降低。在疾病高峰期，觀察到多種代謝物的濃度顯著增加，包括谷氨酰胺、O-磷酸乙醇胺、支鏈氨基酸和腐胺。受影響的途徑包括一氧化氮合成、能量代謝改變、多胺合成和內源性抗氧化劑的含量。EAE發作和高峰兩個時間點獲得的CSF代謝譜顯示出明顯的差異，表明在MBP誘導的神經炎癥過程中CNS代謝發生顯著變化，暗示進展型MS中氨基酸和核苷酸代謝與對照組或復發緩解型（RRMS）相比有差異，可以嘗試通過代謝譜可區分不同時期MS。

DICKENS等［30］第一個使用血清NMR證明復發緩解型（RRMS）和繼發進展型MS（SPMS）代謝物有差異，表明代謝物具有客觀上區分MS的這兩個階段的潛力［29］。HERMAN使用質譜方法證明了SPMS相對于RRMS在腦脊髓液（CSF）中存在明顯的代謝變化。FEDERICA等［31］采用磁共振（H-NMR）和質譜分析（結合氣相色譜和液相色譜）對收集的34例患者的腦脊液和血液兩種樣本（RRMS 22例，PPMS 12例）進行分析發現，RRMS和PPMS的代謝物存在差異，可以鑒定出幾種代謝產物的改變（脂質、生物胺和氨基酸），主要參與的代謝途徑有谷胱甘肽代謝、氮代謝、谷氨酰胺-谷氨酸代謝、精氨酸-鳥氨酸代謝等。其中谷胱甘肽代謝和氮代謝與氧化應激密切相關。GAETANI等［32］利用質譜技術的研究也表明，穩定期MS患者和復發期MS患者的尿液中色氨酸代謝物有差異。這些發現顯示出代謝組學在研究疾病不同分期及進展方面有很大的潛在價值。

2.4鑒別其他神經炎性疾病多發性硬化（MS）和一些其他的炎癥性脫髓鞘疾病，如視神經脊髓炎（NMO），有時難以區分，會增加臨床上的誤診率［33］。為了尋找MS可能的獨特代謝方式和候選生物標志物，MOUSSALLIEH等［34］用質子磁共振光譜對47例MS患者、44例NMO患者和42位對照組患者血清進行代謝組學分析，結果表明鞘肌醇和乙酸鹽分別是MS和NMO的可能血清生物標志物。與對照組相比，在87.8%的MS患者中鞘肌醇增加了0.15～3倍，而在74.3%的NMO患者中，乙酸鹽增加了0.4～7倍，同時使用這兩種代謝物可以區分MS患者和NMO患者（敏感性為94.3%，特異性為90.2%）。PARK等［35］采用質譜代謝物譜方法，從腦脊液樣本中尋找多發性硬化（MS）、視神經脊髓炎（NMOSD）和特發性橫脊髓炎（ITM）的差異代謝物，結果表明，脂類、1-單甘肽和1-單硬脂酸分別是MS、NMOSD和ITM的特異代謝物。FRENCH等［36］將1NMR代謝組學應用于萊姆病、西尼羅河病毒腦膜腦炎、多發性硬化等27例患者和25名健康對照者的CSF樣品，結果表明MS與其他疾病存在差異代謝物。這些結果初步表明，代謝組學作為快速篩查測試可能具有區分其他神經炎性疾病的能力，從而增強診斷準確性的潛在作用。

2.5預測治療反應方面MS是一種需要長期服藥的疾病，且治療費用較高。有些藥物可能對某些患者無效，需要一種手段預測治療的反應，避免無效治療和不必要的花費。中和抗藥物抗體（ADA）可大大降低用于治療多發性硬化患者生物藥物的療效。使用β-干擾素（IFN-β）治療的MS患者中，很多患者發展為ADA。一項研究對89例MS患者血清樣本進行代謝組學分析，測定干擾素β治療前后代謝產物和ADA的變化。成為ADA+的患者在前3個月對干擾素β有明顯的代謝反應，有29種不同的調節代謝物，結果表明血清代謝物是預測干擾素β治療的MS患者ADA發展的一個有前景的生物標志物［37］。一項研究確定IFN-?對MS患者代謝組的影響，以探索可預測治療反應的生物標志物。研究入選了21名開始接受IFN-?治療的MS患者（44μg，每周皮下注射3次），在基線水平和治療6、12、24個月后獲得血液樣本，并通過高分辨率磁共振波譜分析代謝產物的變化。IFN給藥后，根據“無疾病活動證據（無復發、殘疾進展和磁共振成像活動），將患者分為應答者和無反應者。結果表明，有反應者和無反應者代謝物在乳酸、丙酮、3-OH-丁酸、色氨酸和葡萄糖水平方面的差異［38］。有研究評估了富馬酸二甲酯（DMF）對MS患者代謝組學特征的影響，在開始DM之前和開始后6個月對18例MS患者的血漿使用代謝組學方法分析，磷脂、溶血磷脂和縮醛磷脂增加，循環游離脂肪酸減少。此外，脂肪酸水平的改變與淋巴細胞計數，特別是CD8+T細胞亞群之間觀察到很強的相關性，表明DMF誘導的脂質代謝改變與免疫學變化有關［39］。總之，代謝組學方法似乎是一種有前途的工具，可能有助于預測MS治療的效果，從而實現更精確的特異性治療。

2.6治療靶點方面在一項神經系統疾病的研究中描述了膽汁酸代謝異常［40］，這可能歸因于膽汁酸通過調節神經炎癥的神經保護作用。NOTIKO等［41］的研究表明MS患者血液中膽汁酸代謝異常。最近的一項研究也表明膽汁酸代謝在MS中發生了改變，且膽汁酸的補充阻止了星形膠質細胞和小膠質細胞的極化，使神經毒性表型和MS動物模型的神經病理學得到改善［42］。這些發現確定膽汁酸代謝失調是MS的潛在治療靶點，但由于樣本量小還需要更多的研究發現MS的治療靶點。

2.7其他方面對于MS代謝組學的研究多采用腦脊液、血液、尿液等生物學基質。最近研究人員開發了一種新的LC-MS/MS方法，該方法可從眼淚中鑒定出極性脂質、酰基肉堿、游離肉堿和氨基酸，在MS患者中發現了30種淚脂生物標志物，其中一些還存在于這些患者的CSF中。此外，其眼淚中酰基肉堿水平顯著增加［43］。這項研究表明其他基質也可以用于MS代謝組學的研究。

單一組學方法有各自的優勢，但也有局限性。近幾年一些學者開始用多組學方法預測與人類疾病相關的微生物功能和分子機制。基于氣相色譜-質譜法的快速、高靈敏度的檢測方法被用于脂肪酸的定量檢測，是研究腸道微生物群落參與代謝途徑的有效工具［44］。如最近利用16S rRNA測序和糞便代謝組數據，對RRMS、SPMS和與健康密切相關的疾病（HCS）患者的腸道微生物和代謝組進行比較。與HCS相比，每一患者組都有一些物種有明顯的變化，包括短鏈脂肪酸（SCFA）產生菌在MS中減少。與HCS相比，RRMS中丁酸和丙酸的生物合成明顯減少。硫代謝組學發現SPMS中半胱氨酸與半胱氨酸的比值增加，推測SPMS腸道內存在過量的DNA氧化。腸生態環境和功能微環境在MS的不同階段發生了顯著的變化，尤其是RRMS中SCFA的生物合成減少，SPMS中的氧化水平升高是其特征［45-46］。將代謝組學技術與腸道微生物整合，來自人類腸道的微生物群落的生物活性化合物參與了與宿主的微調互聯網絡，協調了各種生理過程。BLANCHET等［47］使用NMR代謝組學和蛋白質組學數據相結合，觀察到EAE所致大鼠腦脊液能量供應和氨基酸代謝與T激肽原1、乳酸或肌醇、補體C3和銅藍蛋白的解除有關，闡明了蛋白質組學和代謝組學的一種新的融合方法在EAE中的應用。這種多組學方法可能更好地了解疾病的病理生理及發病機制，制定新的治療方案。多組學技術尚屬于初步探索階段，需要進一步進行研究。

3 結論與展望

代謝組學作為一種較為新興的研究手段，發展已較為成熟，目前在MS血液、腦脊液等基質中的研究已相對較多。今后可能會需要更大的樣本對MS的代謝組學進行研究，或探索性地在其他基質上進行研究，且隨著檢測技術和生物學技術的不斷發展，將代謝組學技術與其他技術相結合將會成為研究MS的熱點。