術前聯合使用順鉑和中藥大黃素對人食管鱗癌WIG-1 mRNA的影響

肖仁斌

湘雅萍礦合作醫院腫瘤科，江西萍鄉 337000

在20世紀中期食管癌是一種不常見的癌癥，但自20世紀70年代以來，食管下段和胃食管交界處腺癌的發病率呈現穩步上升的趨勢。食管癌（主要是鱗狀細胞癌）在世界部分地區，尤其是東亞地區廣泛流行，該病在早期沒有典型的臨床癥狀，因此大多數患者在發現患有該疾病時已經是中晚期[1-2]。根據全世界癌癥病例的統計數據表明，食管癌的發病率和致死率在全世界全部癌癥發生率和致死率中分別排在第7 位和第6 位，且在我國該病的發生率和致死率是最高的[3]。當前為延長該類疾病患者的存活時間，臨床上通常采用手術切除、放化療、靶向治療以及免疫療法的聯合治療方案[4-5]。臨床相關實驗數據表明，在對患者進行切除手術前進行化療可延長患者的生存時間，并提高其生活質量[6]。順鉑是一種由氯原子和氨分子結合而形成的絡合物，可以有效抑制DNA 的復制階段，進而抑制癌細胞的生長，具有較好的抗癌作用[7]。而大黃素是中藥大黃、虎杖的主要活性成分，是一種蒽醌類衍生物，在臨床上具有抑制免疫活性、抑制癌細胞生長以及抗炎的功效，且其作為治療癌癥的藥物具有低毒性的較大優勢，因此被醫護工作者廣泛關注[8-9]。相關研究表明，野生型p53基因是一種抑癌因子，其野生型p53 誘導基因1（wildtype p53-induced gene，WIG-1）可與癌細胞結合，進而抑制腫瘤的生長[10]。本研究旨在分析術前聯合應用西藥順鉑和中藥大黃素對人食管鱗癌WIG-1 mRNA的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取在湘雅萍礦合作醫院2019年1月—2020年8月接受治療的120 例食管癌鱗癌患者作為研究對象，所有患者均采用西藥順鉑和中藥大黃素聯合用藥的方式進行為期3 個療程的治療。根據術中所取病灶組織部位的不同，將其分為觀察組和對照組。觀察組術中取腫瘤病灶組織，對照組術中取距離腫瘤部位3 cm 以上的癌旁組織，每組各60 例。對照組患者中，男26 例，女34 例；年齡26～83 歲，平均（55.30±7.46）歲；腫瘤直徑1～9 cm，平均（4.49±0.85）cm；腫瘤生長部位，上段25 例，中段19 例，下段16 例；臨床分期：Ⅱ期19 例，Ⅲ期23 例，Ⅳ期18 例。觀察組患者中，男31例，女29 例；年齡25～84 歲，平均（57.30±8.86）歲，腫瘤直徑1～9 cm，平均（4.63±0.69）cm；腫瘤生長部位：上段22 例，中段20 例，下段18 例；臨床分期：Ⅱ期19 例，Ⅲ期22 例，Ⅳ期19 例。兩組的一般資料比較，差異無統計學意義（P>0.05），具有可比性。本研究經湘雅萍礦合作醫院醫學倫理委員會審批通過。

納入標準：①均符合人食管鱗癌的臨床診斷要求，入院后經過病理檢查確診為食管鱗癌；②經體檢患者符合進行手術治療的標準，且在進行手術前聯合服用大黃素和順鉑無較大不良反應，具有較好的耐受性；③患者及其家屬享有知情權，依從性較好，可以服從醫護人員的安排，完成相關檢查。

排除標準：①有嚴重肝、腎等基礎重大疾病患者；②有家族遺傳史、精神異常的患者；③入院時腫瘤已發生擴散和轉移的患者。

1.2 儀器與試劑

1.2.1 儀器

無菌操作臺，恒溫培養箱，4℃離心機（離心半徑15 cm），實時熒光定量分析儀，電泳儀、精密電子分析天平、pH 劑、恒溫加熱水浴鍋、高分辨光學顯微鏡、酶標儀（Sartorius，USA）。

1.2.2 試劑

RNA 提取試劑盒，CYBR-GREEN 熒光劑，DEPC水、TaqDNA 鏈式反應聚合酶（Thermofisher，Japan），TOX 酶、瓊脂糖、牛血清白蛋白，免疫組化試劑盒等（Sigma，USA）。

1.3 方法

所有患者在確診后，均接受大黃素（Sigma，貨號：E7881）聯合順鉑（山東齊魯制藥，生產批號：006013CF）的術前治療方案。

1.3.1 配制大黃素溶液

稱取大黃素數十克，充分溶解于二甲基亞砜中，并用配套濾膜進行無菌濾過，最終母液濃度為5 mg/mL，于-20℃冰箱中冷凍保存。進行試驗時，將母液稀釋為30 μg/mL 以及60 μg/mL[11-12]。

1.3.2 病灶樣本采集

在3 個療程結束后對患者進行手術治療，在手術中取出患者的病灶組織和癌旁組織，溶于滅菌生理鹽水中，于-20℃冰箱中冷凍保存。進行試驗時用培養基將其稀釋為5 μg/mL 以及10 μg/mL[13]。

1.3.3 WIG-1 mRNA的表達

1.3.3.1 mRNA 提取 ①裂解液配制：巰基乙醇按體積比100∶1 進行配制；②70%乙醇配制；③將待測樣本用37℃PBS 沖洗后，加入配制好的裂解液，渦旋使其充分溶解至液體澄清透明；④將全部液體轉移至藍色過濾柱，15 000g，離心2 min；⑤棄去藍色過濾柱，在濾液中加入等量70%乙醇，攪拌均勻；⑥轉移至紅色過濾柱中，15 000g，離心15 s；⑦棄去濾液，加入Wash Solution 1，500 μL，15 000g，離心15 s；⑧棄去濾液，加入Wash Solution 2，500 μL，15 000g，離心15 s；⑨將過濾柱轉移至新管中，加入洗脫液50 μL，15 000g，離心1 min；⑩應用酶標儀在260/280 nm 處對提取的mRNA 濃度及純度進行測量。

1.3.3.2 cDNA 合成 利用TaqDNA 合成酶對提取的mRNA 進行反轉錄。

1.3.3.3 實時熒光定量聚合酶鏈反應（real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction，RT-PCR）測定 采用相對定量法對WIG-1 進行測定。內標基因為GAPDH，正向引物為5′-AGTGGGAAATCGCCTGTG-3′，反向引物為5′-CAGGGTACATTCGTGGTGC-3′。目標基因WIG-1 正向引物為5′-CCAACTGTCTCCTCAGACCC-3′，反向引物為5′-CCTGGGCATCTATACAGTCC-3′。總反應體系為10 μL，反應條件為：25℃，10 min；45℃，30 min；98℃，5 min。連續循環60 次。

1.4 觀察指標

通過RT-PCR 測定結果比較兩組WIG-1 mRNA表達水平，并記錄觀察組手術前后食管鱗癌組織和癌旁組織中WIG-1 mRNA的表達量。

1.5 統計學方法

采用SPSS 21.0 統計學軟件進行數據分析，計量資料用均數±標準差（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗；計數資料采用率表示，組間比較采用χ2檢驗，以P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組WIG-1 mRNA 表達水平的比較

觀察組腫瘤組織的WIG-1 mRNA 表達水平為（0.79±0.14），高于對照組的（0.06±0.02），差異有統計學意義（t=24.379，P<0.05）。

2.2 觀察組手術前后腫瘤組織WIG-1 mRNA 表達水平的比較

觀察組患者在接受手術后腫瘤組織的WIG-1 mRNA 表達水平為（0.24±0.04），低于術前的（0.79±0.14），差異有統計學意義（t=12.150，P<0.05）。

3 討論

目前順鉑是用于治療癌癥較為常用的化療藥物之一，其可以較為有效地抑制腫瘤細胞的生長。臨床數據表明，順鉑用于治療人食管鱗癌的作用機制是通過誘導p53 和p73 兩種細胞的凋亡通路進而抑制腫瘤細胞的增殖[14-15]。但其也具有較大的不良反應，隨著用藥時間的延長，患者逐漸出現惡心、嘔吐等副作用，使其依從性減弱。因此聯合用藥成為目前治療的主流手段[16-17]。

大黃素是從中藥大黃等植物中提取的活性成分，可以有效清除體內自由基，進而發揮抗腫瘤的功效。相關臨床研究數據顯示，大黃素可以調節多種通路，進而達到抗腫瘤的效果[18]。本研究旨在分析聯合應用西藥順鉑和中藥大黃素對人食管鱗癌WIG-1 mRNA的影響，結果顯示，觀察組腫瘤組織的WIG-1 mRNA表達水平高于對照組，差異有統計學意義（P<0.05）。且觀察組患者在接受手術后腫瘤組織的WIG-1 mRNA表達水平降低，差異有統計學意義（P<0.05）。提示術前聯合使用順鉑和大黃素可降低人食管鱗癌WIG-1 mRNA的表達水平。

綜上所述，WIG-1 mRNA 基因在未發病組織中表達量較少，且在術前聯用西藥順鉑和中藥大黃素對食管鱗癌患者進行治療有利于減少WIG-1 mRNA 基因的表達量，可較好地改善患者的預后，進而為食管鱗癌的治療提供臨床及分子學依據。