吲哚喹嗪類小分子DNMT抑制劑的合成及抗腫瘤活性研究

胡正雄，阿依江·瑪爾瑪爾，孫冉，趙星宇，桂琳，王玉記

（首都醫科大學藥學院，北京 100069）

0 引言

DNA甲基化在目前研究界有著極大的的基因表達調節作用，DNMT抑制劑具備有效抑制腫瘤生長性能，獲得了較好的運用效果。目前DNMT小分子抑制劑主要包括了核苷酸類DNMT抑制劑、非核苷酸類DNMT抑制劑[1]。本次研究將對分析吲哚喹嗪類小分子DNMT抑制劑的合成及抗腫瘤活性展開研究，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料。選取雄性小鼠共10只，體重均為160-190g，平均體重為（176.6±13.9）g。

1.2 方法。糖類藥物是人類重要的藥物之一，在先導化合物結構優化方法中，引入糖是常見的方法。利用藥物化學中的拼合原理，以 3-乙?；?4-氧代-吲哚[2，3-a]喹嗪-6-羧酸（IMQ）和 3-乙酰基-6-（乙氧羰甲基）-吲哚并[2，3-a]喹嗪（IOQ）為母核，分別與二十種天然氨基酸、氨基己酸、D-葡萄糖鹽酸鹽及D-葡萄糖醛酸縮合，制備了46種新型的單糖修飾的吲哚喹嗪類衍生物IMQAA和IOQ-AA（AA為二十種天然氨基酸、氨基己酸、D-葡萄糖鹽酸鹽及D-葡萄糖醛酸）。經核磁、質譜、紅外確定結構正確，并測定了熔點、旋光等理化常數。

2 結果

對于DNMT抑制率，在化合物中以2、10、15、16、21、22以上6個化合物，分別達到8.5、9.6、16、2.7、14、1.2μM的半數抑制率（表1）。

在0.1 μmol/kg劑量下，2、12、42這3個化合物，能夠誘導HCT116細胞凋亡，凋亡細胞隨著這三個化合物濃度的逐漸增加同樣明顯增加（表2）。經試驗發現以2、14、42這三個化合物，能夠達到對DNMT1的活性抑制作用三個目標化合物的抗炎活性呈現劑量依賴性，在1 μmol/kg劑量下對炎癥小鼠的肌酐含量、谷丙轉氨酶和谷草轉氨酶活力無影響。

表1 化合物對于DNMT抑制率探究

表2 化合物誘導HCT116細胞凋亡

在1 μmol/kg劑量下，IMQ-Asn、IMQ-AHA和IOQ-Gla（化合物2、14、42）在S180小鼠移植性腫瘤模型上體現了一定的抗腫瘤活性，抑瘤率分別為40.7%、35.5%和37.9%。IMQ-Asn、IMQ-AHA和IOQ-Gla（化合物2、14、42）能顯著性下調荷瘤小鼠血漿中腫瘤壞死因子-α（TNF-α）及白細胞介素-6（IL-6）的水平，上調P53水平（表3）。三個目標化合物的抗腫瘤活性呈現劑量依賴性，在1 μmol/kg劑量下對荷瘤小鼠的各臟體比、肌酐含量、谷丙轉氨酶和谷草轉氨酶活力無影響。

在0.1 μmol/kg劑量下，IMQ-Asn、IMQ-AHA和IOQ-Gla（化合物2、14、42）在Lewis肺癌小鼠轉移模型上體現了一定的體內抗腫瘤轉移活性，發生肺部瘤節轉移的小鼠數量有所下降，同時在發生肺部轉移的小鼠體內，轉移瘤節個數有顯著性降低，并在抑制腫瘤轉移的同時一定程度上抑制Lewis腫瘤的生長。IMQ-Asn、IMQ-AHA和IOQ-Gla（化合物2、14、42）均能顯著性下調Lewis肺癌小鼠血清中基質金屬蛋白酶-9（MMP-9）的水平（表4）。

表3 化合物在S180小鼠移植性腫瘤模型中的抑瘤率

表4 化合物在Lewis肺癌小鼠轉移模型中的體內抗腫瘤轉移活性

3 討論

DNA甲基化在基因中對于基因突變、表達調控、增殖分化多方面都發揮關鍵作用，一般情況下DNA甲基化異常，也被認為誘發腫瘤的關鍵要因[3]。需要經DAMT催化，其中DNMT1作為哺乳動物中的含量最高活性催化，所以對DNMT活性阻斷抑制能夠達到抗腫瘤活性。通過在本次研究中進行小鼠研究，以吲哚喹嗪為原料分析小分子DNMT抑制劑合成，共計有44個吲哚喹嗪類小分子DNMT化合物[4]。并運用ELISA方法基于SAH作為陽性用藥，對合成吲哚喹嗪類小分子衍生物產生的DNMT1催化活性影響，結果發現18個化合物均對于DNMT1催化活性達到不同程度影響，以2、12、25、26、41、42以上6個化合物，分別達到10、9.6、16、2.7、14、1.2μM的半數抑制率，其中化合物42能夠達到最佳的抑制效果。在2、12、42這3個化合物，能夠誘導HCT116細胞凋亡，凋亡細胞隨著這三個化合物濃度的逐漸增加同樣明顯增加。化合物產生的DNMT1活性催化作用影響，有關吲哚喹嗪母核及側鏈，主要表現規律如下[5]：通過在吲哚喹嗪母核側鏈內將吲哚環引入，能夠實現抑制DNMT1活性作用最佳化；吲哚喹嗪母核側鏈對苯乙基取代時，側鏈取代基活性以吲哚環最顯著，其次是芳基、環丙基。經本次研究MTT測試結果發現：多數化合物均可以對實驗中選取的HCT116、NHK-45、A549這三個腫瘤細胞受試株的增殖產生抑制作用，并且這三種腫瘤細胞增殖影響，正相關于藥物作用濃度，前兩個腫瘤細胞抑制作用依賴時間，且2、42這兩種化合物均能達到較強的抑制腫瘤細胞作用。以咔唑類小分子衍生物，產生的選擇性腫瘤細胞抑制作用展開深入研究，發現發現吲哚喹嗪類小分子衍生物達到的抗腫瘤活性差異性，這一情況可能有關于化合物結構。

細胞周期作為細胞參與生命活動的基本過程，主要指的是以細胞分裂結束作為開始，直至下次細胞分裂結束完成。共計劃分三期細胞周期，分別為G1、S、G2、M、G0期。腫瘤細胞具備的基本生物學特征，就是能夠破壞細胞周期調控機制，所致腫瘤細胞產生失控、分化受阻、異常凋亡情況。多數抗腫瘤藥物還能夠達到在細胞周期的G1期便有效阻滯[6]。經本次研究的細胞周期實驗結果證實，2、12、42這三類化合物，能夠實現HCT116細胞于G1期便有效阻滯，從而阻止加倍復制DNA至S期、M期，有效實現腫瘤細胞的緩慢生長，并降低腫瘤細胞的增值活性。細胞凋亡則為了能夠對內環境穩定性有效維持，由基因控制細胞自主有序死亡。細胞凋亡能夠對多細胞生物的正常生長發育有效維持，并且維持細胞內環境的穩定性，以及抵御外界多因素干擾。腫瘤細胞無限生長作為腫瘤細胞凋亡所受抑制的結果，所以凋亡障礙同腫瘤的發生以及后續發展密切相關。經近年來臨床研究證實，諸多抗腫瘤藥物均有可能所致腫瘤細胞發生凋亡，因此實現抗腫瘤效果。本次的研究結果也證實HCT116細胞凋亡，受化合物2、12、42誘導作用，濃度增加隨之增加凋亡細胞。

綜上所述，在吲哚喹嗪類小分子DNMT抑制劑中共計包括44個小分子化合物，經試驗發現以2、14、42這三個化合物，能夠達到對DNMT1的活性抑制作用，對三種腫瘤細胞達到強抑制作用。