痰液結核分枝桿菌檢測診斷肺結核①

馬劍鋒

(洛陽市澗西區疾病預防控制中心<傳染病預防控制所>,河南 洛陽 471003)

肺結核是嚴重威脅人類生命健康的呼吸道傳染性疾病,肺結核感染使機體的免疫能力減弱,免疫應答功能紊亂。在肺結核患病的早期進行診斷和治療有利于患者康復,早期明確診斷、合理用藥對改善肺結核患者的預后有意義[1-2]。因此,準確、可靠的診斷方法是關鍵[3]。筆者探討細菌培養、涂片抗酸染色、熒光定量聚合酶鏈式反應(TB-PCR)與結核分枝桿菌/利福平耐藥實時熒光定量核酸擴增檢測技術(Xpert MTB/RIF)檢測肺結核的效能。

1 資料與方法

1.1 一般資料

2018年3月至2019年3月洛陽市澗西區疾病預防控制中心收治的60例肺結核的患者,男38例,女22例;年齡30~70歲,平均(52.7±14.4)歲。患者病情符合肺結核診斷標準[2],無其他感染,無心、肺功能障礙。

1.2 方法

采集患者痰液樣本,分別采用MTB培養法、涂片抗酸染色法、熒光定量聚合酶鏈式反應(TB-PCR)及結核分枝桿菌/利福平耐藥實時熒光定量核酸擴增技術(Xpert MTB/RIF)檢測MTB。

1.2.1 儀器與試劑 酸性改良羅氏培養基,分枝桿菌(Middlebrook 7H9)培養基干粉(美國Becton Dickinson公司),抗酸染色試劑盒(濟南百博生物技術股份有限公司),結核分枝桿菌PCR擴增試劑盒(上海宏錦公司);熒光定量PCR儀(美國應用生物公司)。

1.2.2 樣本檢測 ①MTB培養法:痰液標本高速離心5 min,洗滌沉淀后,接種于培養管;每60 min使用熒光強度記憶探測器檢測培養管中的熒光強度。②涂片抗酸染色法:樣本涂抹于玻片正中央,晾干,滴加2滴石碳酸復紅染色液,夾持玻片在酒精燈上加熱5 min,冷卻后,冷水沖洗;滴加3%鹽酸酒精脫色1 min,晾干后,冷水沖洗;滴加堿性美蘭溶液進行復染,1 min后,冷水沖洗,晾干后,滴加香柏油,顯微鏡觀察。③熒光定量TB-PCR:痰液標本加消化液液化30 min,高速低溫離心,棄上清液,取沉淀加DNA提取液,充分混勻后,離心分離DNA;取適量DNA進行PCR擴增;計算機自動分析標本中的拷貝數。④Xpert MTB/RIF分析:按照Xpert MTB/RIF試劑盒說明書進行操作,痰液標本與NaOH及異丙醇處理液按1∶2混合,高速低溫離心,取混合液2 ml轉移至1次性多室塑料反應盒中,將反應盒放置檢測模塊進行分析。

1.3 結果判定

①MTB培養法:斜面有MTB菌落生長為陽性,反之則為陰性。②涂片抗酸染色法:顯微鏡下觀察到抗酸桿菌,則判定為陽性,反之則為陰性。③熒光定量TB-PCR法:樣本檢測Ct值≤38,同時擴增曲線表現為S型,則判定為陽性;Ct值>38、≤40,需重復測定;如果Ct值仍為>38、≤40,同時擴增曲線表現為S型,則判定為陽性;如果Ct值≥40,則代表檢測樣本低于檢測限,則判定為陰性[4]。④Xpert MTB/RIF法:反應結束后,在檢測系統的窗口下,直接觀察、判定結果。

1.4 統計學方法

采用SPSS 20.0軟件處理數據,P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

60例肺結核患者痰液標本經MTB培養法、涂片抗酸染色法、熒光定量TB-PCR法和Xpert MTB/RIF法檢測,MTB的檢出率分別為56.7%、60.0%、83.3%和95.0%。Xpert MTB/RIF法的陽性檢出率高于MTB培養法、涂片抗酸染色法和熒光定量TB-PCR法,差異有統計學意義(P<0.05);熒光定量TB-PCR法的陽性檢出率高于MTB培養法和涂片抗酸染色法(P<0.05);MTB培養法與涂片抗酸染色法比較,陽性檢出率無統計學差異(P>0.05)。

3 討論

肺結核是MTB感染肺的傳染性疾病。MTB的菌體結構復雜,具有抗酸性能強、生長較緩慢、多形性且抵抗力高等特點,主要通過呼吸道感染;感染后,使肺泡以及支氣管的上皮細胞喪失纖維黏素,呈現不同程度的肺部感染癥狀。可經消化道及皮膚黏膜破損處等途徑感染機體,侵犯組織臟器,影響患者健康[5-7]。早期診斷MTB對積極開展治療、改善預后均有重要意義。

肺結核的細菌學檢查是診斷和確定肺結核的重要手段,對治療結核病患者和阻止MTB傳染有重要意義[8]。MTB培養法和涂片抗酸染色法是實驗室細菌學檢查最基本的方法,其中MTB培養法的敏感性、特異性及準確性均較高,被認為是臨床診斷結核病的金標準,但MTB培養周期長,不利于結核病的早期診斷及治療[9]。涂片抗酸染色法具有價廉、簡便且快速等優勢,但其診斷靈敏度較低。隨著研究的深入和技術的進步,熒光定量TB-PCR法被逐漸應用于檢測MTB[10-11],該檢驗手段主要是利用聚合酶鏈式反應及熒光定量技術對MTB基因進行檢測,靈敏度和適用性較高,能快速做出診斷。Xpert MTB/RIF法是以全自動半巢式實時PCR技術為基礎,利用對MTB特有的序列rpoB基因上與利福平耐藥相關的81 bp的核心區間進行檢測,能快速診斷患者是否感染MTB,以及是否對利福平耐藥[12]。本研究結果顯示,60例肺結核患者痰液標本經MTB培養法、涂片抗酸染色法、熒光定量TB-PCR法和Xpert MTB/RIF法檢測,其陽性檢出率存在明顯差異,其中Xpert MTB/RIF法最靈敏,檢出率達95.00%,與臨床診斷極為接近;熒光定量TB-PCR法的陽性檢出率為83.33%,顯著高于MTB培養法和涂片抗酸染色法的56.67%、60.00%。提示Xpert MTB/RIF法對肺結核患者痰液標本MTB的陽性檢出率最高。Pimkina等[13]研究發現,Xpert MTB/RIF在涂片抗酸染色體陽性、培養陽性和涂片陰性標本及培養陰性標本中檢測出MTB高達97.8%和82.5%,說明肺結核患者行Xpert MTB/RIF檢測對診斷和后續治療均有較大幫助。此外,Xpert MTB/RIF檢測集樣品準備、擴增、檢測為一體,自動化程度高,可同時檢測多個樣本,從標本處理至結果報告不超過2 h,比其他3種檢測方法省時、省事。另外,Xpert MTB/RIF還能提供利福平耐藥基因突變信息,為肺結核的快速診斷和治療提供了重要參考[14]。

綜上所述,應用不同方法檢測肺結核患者痰液標本的MTB存在明顯差異,4種檢測方法中,以Xpert MTB/RIF的陽性檢出率最高。因此,在肺結核診斷中,應綜合多種途徑進行診斷,避免漏診,以便及早發現肺結核,改善患者預后。