痰液結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)診斷肺結(jié)核①

馬劍鋒

(洛陽(yáng)市澗西區(qū)疾病預(yù)防控制中心<傳染病預(yù)防控制所>,河南 洛陽(yáng) 471003)

肺結(jié)核是嚴(yán)重威脅人類(lèi)生命健康的呼吸道傳染性疾病,肺結(jié)核感染使機(jī)體的免疫能力減弱,免疫應(yīng)答功能紊亂。在肺結(jié)核患病的早期進(jìn)行診斷和治療有利于患者康復(fù),早期明確診斷、合理用藥對(duì)改善肺結(jié)核患者的預(yù)后有意義[1-2]。因此,準(zhǔn)確、可靠的診斷方法是關(guān)鍵[3]。筆者探討細(xì)菌培養(yǎng)、涂片抗酸染色、熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(TB-PCR)與結(jié)核分枝桿菌/利福平耐藥實(shí)時(shí)熒光定量核酸擴(kuò)增檢測(cè)技術(shù)(Xpert MTB/RIF)檢測(cè)肺結(jié)核的效能。

1 資料與方法

1.1 一般資料

2018年3月至2019年3月洛陽(yáng)市澗西區(qū)疾病預(yù)防控制中心收治的60例肺結(jié)核的患者,男38例,女22例;年齡30~70歲,平均(52.7±14.4)歲。患者病情符合肺結(jié)核診斷標(biāo)準(zhǔn)[2],無(wú)其他感染,無(wú)心、肺功能障礙。

1.2 方法

采集患者痰液樣本,分別采用MTB培養(yǎng)法、涂片抗酸染色法、熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(TB-PCR)及結(jié)核分枝桿菌/利福平耐藥實(shí)時(shí)熒光定量核酸擴(kuò)增技術(shù)(Xpert MTB/RIF)檢測(cè)MTB。

1.2.1 儀器與試劑 酸性改良羅氏培養(yǎng)基,分枝桿菌(Middlebrook 7H9)培養(yǎng)基干粉(美國(guó)Becton Dickinson公司),抗酸染色試劑盒(濟(jì)南百博生物技術(shù)股份有限公司),結(jié)核分枝桿菌PCR擴(kuò)增試劑盒(上海宏錦公司);熒光定量PCR儀(美國(guó)應(yīng)用生物公司)。

1.2.2 樣本檢測(cè) ①M(fèi)TB培養(yǎng)法:痰液標(biāo)本高速離心5 min,洗滌沉淀后,接種于培養(yǎng)管;每60 min使用熒光強(qiáng)度記憶探測(cè)器檢測(cè)培養(yǎng)管中的熒光強(qiáng)度。②涂片抗酸染色法:樣本涂抹于玻片正中央,晾干,滴加2滴石碳酸復(fù)紅染色液,夾持玻片在酒精燈上加熱5 min,冷卻后,冷水沖洗;滴加3%鹽酸酒精脫色1 min,晾干后,冷水沖洗;滴加堿性美蘭溶液進(jìn)行復(fù)染,1 min后,冷水沖洗,晾干后,滴加香柏油,顯微鏡觀察。③熒光定量TB-PCR:痰液標(biāo)本加消化液液化30 min,高速低溫離心,棄上清液,取沉淀加DNA提取液,充分混勻后,離心分離DNA;取適量DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增;計(jì)算機(jī)自動(dòng)分析標(biāo)本中的拷貝數(shù)。④Xpert MTB/RIF分析:按照Xpert MTB/RIF試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作,痰液標(biāo)本與NaOH及異丙醇處理液按1∶2混合,高速低溫離心,取混合液2 ml轉(zhuǎn)移至1次性多室塑料反應(yīng)盒中,將反應(yīng)盒放置檢測(cè)模塊進(jìn)行分析。

1.3 結(jié)果判定

①M(fèi)TB培養(yǎng)法:斜面有MTB菌落生長(zhǎng)為陽(yáng)性,反之則為陰性。②涂片抗酸染色法:顯微鏡下觀察到抗酸桿菌,則判定為陽(yáng)性,反之則為陰性。③熒光定量TB-PCR法:樣本檢測(cè)Ct值≤38,同時(shí)擴(kuò)增曲線表現(xiàn)為S型,則判定為陽(yáng)性;Ct值>38、≤40,需重復(fù)測(cè)定;如果Ct值仍為>38、≤40,同時(shí)擴(kuò)增曲線表現(xiàn)為S型,則判定為陽(yáng)性;如果Ct值≥40,則代表檢測(cè)樣本低于檢測(cè)限,則判定為陰性[4]。④Xpert MTB/RIF法:反應(yīng)結(jié)束后,在檢測(cè)系統(tǒng)的窗口下,直接觀察、判定結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0軟件處理數(shù)據(jù),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

60例肺結(jié)核患者痰液標(biāo)本經(jīng)MTB培養(yǎng)法、涂片抗酸染色法、熒光定量TB-PCR法和Xpert MTB/RIF法檢測(cè),MTB的檢出率分別為56.7%、60.0%、83.3%和95.0%。Xpert MTB/RIF法的陽(yáng)性檢出率高于MTB培養(yǎng)法、涂片抗酸染色法和熒光定量TB-PCR法,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);熒光定量TB-PCR法的陽(yáng)性檢出率高于MTB培養(yǎng)法和涂片抗酸染色法(P<0.05);MTB培養(yǎng)法與涂片抗酸染色法比較,陽(yáng)性檢出率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。

3 討論

肺結(jié)核是MTB感染肺的傳染性疾病。MTB的菌體結(jié)構(gòu)復(fù)雜,具有抗酸性能強(qiáng)、生長(zhǎng)較緩慢、多形性且抵抗力高等特點(diǎn),主要通過(guò)呼吸道感染;感染后,使肺泡以及支氣管的上皮細(xì)胞喪失纖維黏素,呈現(xiàn)不同程度的肺部感染癥狀。可經(jīng)消化道及皮膚黏膜破損處等途徑感染機(jī)體,侵犯組織臟器,影響患者健康[5-7]。早期診斷MTB對(duì)積極開(kāi)展治療、改善預(yù)后均有重要意義。

肺結(jié)核的細(xì)菌學(xué)檢查是診斷和確定肺結(jié)核的重要手段,對(duì)治療結(jié)核病患者和阻止MTB傳染有重要意義[8]。MTB培養(yǎng)法和涂片抗酸染色法是實(shí)驗(yàn)室細(xì)菌學(xué)檢查最基本的方法,其中MTB培養(yǎng)法的敏感性、特異性及準(zhǔn)確性均較高,被認(rèn)為是臨床診斷結(jié)核病的金標(biāo)準(zhǔn),但MTB培養(yǎng)周期長(zhǎng),不利于結(jié)核病的早期診斷及治療[9]。涂片抗酸染色法具有價(jià)廉、簡(jiǎn)便且快速等優(yōu)勢(shì),但其診斷靈敏度較低。隨著研究的深入和技術(shù)的進(jìn)步,熒光定量TB-PCR法被逐漸應(yīng)用于檢測(cè)MTB[10-11],該檢驗(yàn)手段主要是利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)及熒光定量技術(shù)對(duì)MTB基因進(jìn)行檢測(cè),靈敏度和適用性較高,能快速做出診斷。Xpert MTB/RIF法是以全自動(dòng)半巢式實(shí)時(shí)PCR技術(shù)為基礎(chǔ),利用對(duì)MTB特有的序列rpoB基因上與利福平耐藥相關(guān)的81 bp的核心區(qū)間進(jìn)行檢測(cè),能快速診斷患者是否感染MTB,以及是否對(duì)利福平耐藥[12]。本研究結(jié)果顯示,60例肺結(jié)核患者痰液標(biāo)本經(jīng)MTB培養(yǎng)法、涂片抗酸染色法、熒光定量TB-PCR法和Xpert MTB/RIF法檢測(cè),其陽(yáng)性檢出率存在明顯差異,其中Xpert MTB/RIF法最靈敏,檢出率達(dá)95.00%,與臨床診斷極為接近;熒光定量TB-PCR法的陽(yáng)性檢出率為83.33%,顯著高于MTB培養(yǎng)法和涂片抗酸染色法的56.67%、60.00%。提示Xpert MTB/RIF法對(duì)肺結(jié)核患者痰液標(biāo)本MTB的陽(yáng)性檢出率最高。Pimkina等[13]研究發(fā)現(xiàn),Xpert MTB/RIF在涂片抗酸染色體陽(yáng)性、培養(yǎng)陽(yáng)性和涂片陰性標(biāo)本及培養(yǎng)陰性標(biāo)本中檢測(cè)出MTB高達(dá)97.8%和82.5%,說(shuō)明肺結(jié)核患者行Xpert MTB/RIF檢測(cè)對(duì)診斷和后續(xù)治療均有較大幫助。此外,Xpert MTB/RIF檢測(cè)集樣品準(zhǔn)備、擴(kuò)增、檢測(cè)為一體,自動(dòng)化程度高,可同時(shí)檢測(cè)多個(gè)樣本,從標(biāo)本處理至結(jié)果報(bào)告不超過(guò)2 h,比其他3種檢測(cè)方法省時(shí)、省事。另外,Xpert MTB/RIF還能提供利福平耐藥基因突變信息,為肺結(jié)核的快速診斷和治療提供了重要參考[14]。

綜上所述,應(yīng)用不同方法檢測(cè)肺結(jié)核患者痰液標(biāo)本的MTB存在明顯差異,4種檢測(cè)方法中,以Xpert MTB/RIF的陽(yáng)性檢出率最高。因此,在肺結(jié)核診斷中,應(yīng)綜合多種途徑進(jìn)行診斷,避免漏診,以便及早發(fā)現(xiàn)肺結(jié)核,改善患者預(yù)后。