基于網絡藥理學和分子對接探討散寒化濕宣肺方抗新型冠狀病毒活性化合物的初步研究*

杜帥琳 王 玉 張 玲 萬海同

（浙江中醫藥大學，浙江 杭州 310053）

新型冠狀病毒肺炎（COVID-19）是由新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）引起，具有潛伏期長、感染性強、傳播范圍廣的特點［1］。COVID-19可通過飛沫傳播和密切接觸傳播，各類人群均易感，感染后會出現乏力、干咳和發熱的現象，嚴重者會引起急性呼吸衰竭、腎功能衰竭，甚至死亡［1-3］。截至北京時間2020年3月15日24時，全球共127個國家和地區報告COVID-19，其中，中國累計報告確診80 860例，死亡3 213例；其他國家累計確診61 518例，死亡2 199例。目前韓國、意大利、伊朗疫情持續嚴峻，根據目前形勢，COVID-19有轉成慢性疾病的可能，與人類共存。COVID-19尚無特效藥，推薦使用的化學藥如阿比多爾等可能導致惡心、腹瀉、頭暈、血清轉氨酶增高等不良反應［4］，目前臨床中主要是中西醫結合對癥治療。中醫的整體觀念與辨證論治特點在COVID-19治療中凸顯出優勢，因此從現有有效中醫方劑中篩選抗SARS-CoV-2的活性化合物，對提高COVID-19的治療效果具有重要意義。

散寒化濕宣肺方（SHXF）為《新型冠狀病毒肺炎診療方案（試行第七版）》推薦用藥，適用于COVID-19普通型患者的臨床治療［5］，癥見低熱、身熱不揚、干咳、少痰、胸悶、脘痞等。該方由蒼術、陳皮、厚樸、藿香、草果、生麻黃、羌活、生姜、檳榔組成，具有外散寒邪、宣肺祛濕的功效。網絡藥理學［6］強調從生物網絡平衡的角度來分析藥物所含的各種活性成分作用于機體的多個位點及其產生作用的一系列途徑，相較于傳統藥理學更注重整體性和系統性，符合中醫整體觀念。分子對接是利用計算機技術模擬分析受體的特征以及受體和藥物分子間的相互作用關系，從而實現配體與受體活性位點低能結合的較為成熟的藥物設計技術［7］。本研究旨在討論SHXF所含活性化合物及其作用靶點，并將該方核心化合物與抗新型冠狀病毒靶向蛋白SARSCoV-2 3CL水解酶和Nsp15進行分子對接，以期篩選SHXF抗SARS-CoV-2的活性化合物，提高臨床療效。

1 資料與方法

1.1 方劑中藥化合物與靶點的收集及標準化處理在中藥系統藥理學數據庫與分析平臺數據庫TCMSP［8］（http：//tcmspw.com/tcmsp.php）檢索SHXF中所含化合物及其標靶蛋白，根據藥代動力學（ADME）設定口服生物利用度（OB≥30%）和類藥性（DL≥0.18），篩選獲得待分析化合物。在BATMAN-TCM（http：//bionet.ncpsb.org/batman-tcm/）設置條件為score≥20，P＜0.5收集篩選出的備用化合物靶點，剔除非人源靶點。整理所得靶點，刪除重復項，獲得待處理靶點。將TCMSP數據庫所預測標靶蛋白運用R語言轉化為基因名稱，整合來自BATMAN-TCM數據庫的靶點，經UniProt［9］（https：//www.uniprot.org/）和 GeneCards［10］（https：//www.genecards.org/）進行標準化處理，形成數據集。

1.2 “藥材-化合物-靶點”網絡圖的構建 將化合物-靶點數據集導入網絡可視化軟件Cytoscape3.7.1中，進行可視化，繪制“藥材-化合物-靶點”網絡圖。分析運用“Network Analyze”插件分析網絡拓撲參數，計算節點度值（Degree）、介度中心性（Betweenness Centrality）及緊密度中心性（Closeness Centrality）的中位數，選取大于3個特值中位數的化合物和靶點作為關鍵化合物與靶點。

1.3 PPI網絡構建 將關鍵蛋白標靶導入String數據庫（https：//string-db.org/）得到蛋白質互作網絡圖（PPI），再將其導入Cytoscape3.7.1軟件中，進行可視化，分析蛋白質之間的作用關系。

1.4 靶點的基因富集與通路富集分析 將上述關鍵標靶蛋白導入 DAVID［11］數據庫（https：//david.ncifcrf.gov/home.jsp），條件選擇“OFFICIAL_GENE_SYMBOL”；“Gene list”；Homo sapiens（Human）。分別在生物學過程（BP）、細胞組件（CC）和分子功能（MF）和對預測靶點的基因及其產物進行功能定義分析。進行GO富集分析和KEGG信號通路富集分析，限定物種為“Human”，篩選校正后P＜0.05的結果作為SHXF化合物標靶蛋白的作用機制。

1.5 成分-靶點分子對接 從PubChem（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）數據庫下載SHXF關鍵化合物的3D結構，導入PyMOL軟件。從PDB［12］（https：//www.rcsb.org/）數據庫下載SARS-CoV-2 3CL水解酶（PDB ID：6LU7）和 Nsp15（PDB ID：6VWW）的結構，PyMOL軟件對蛋白質進行去水、加氫等操作，利用AutoDockVina軟件進行對接并分析結果。

2 結果

2.1 SHXF活性化合物與靶點 在TCMSP數據庫共檢索得到SHXF活性化合物85個，其中蒼術9個、陳皮5個、厚樸2個、藿香11個、草果8個、麻黃23個、羌活14個、生姜5個、檳榔8個（見表1）。經篩選總共獲取214個作用靶點。所得化合物和靶點中有20.63%的化合物作用靶點≥10，其中9個化合物作用靶點多于20個，同時也存在多種化合物共同作用于1個靶點的現象，這也證明了中藥復方多成分、多靶點的特性。

2.2 “藥材-化合物-靶點”網絡圖 藥材-化合物-靶點網絡圖共包括277個節點（63個化合物節點、214個靶點節點）和2 096條邊（見圖1）。其中MOL000098-槲皮素為藿香、草果、生麻黃的共有化合物，MOL004328-柚皮素為陳皮、生麻黃共有化合物，MOL000358-β-谷甾醇為生麻黃、羌活、生姜共有化合物。經拓撲分析共獲取19個關鍵化合物，74個關鍵靶點。其中排名前5的化合物為MOL000098-槲皮素、MOL000358-β-谷甾醇、MOL004328-柚皮素、MOL000449-豆甾醇、MOL000422-山奈酚，分別能與135、26、31、26、63個靶點蛋白發生相互作用。

表1 SHXF中部分活性化合物

圖1 SHXF“藥材-化合物-靶點”網絡圖

2.3 PPI網絡分析 將74個關鍵靶點導入String網絡構建平臺，構建蛋白質互作網絡，經Cytoscape3.7.1軟件可視化共得到68個節點，2 902條邊（見圖2）。節點越大，說明度值越高，靶點所參與的生物過程越多；邊越粗、顏色越深說明標靶蛋白之間的相互作用越強，聯系越高。其中Akt1、IL-6、MAPK3、VEGFA、JUN等度值最大，說明其參與的生物活動最多（見表2）。

2.4 靶點通路分析 經GO富集分析共得到599條GO信息（P＜0.05），其中GO-BP 460個條目，GO-CC 55個條目，GO-MF 84個條目（見圖3）。KEGG通路富集分析共得到113條通路（P＜0.05），其中涉及甲型流感（Influenza A）信號通路、TLR信號通路、HIF-1信號通路、PI3K-Akt信號通路等，選取前20條作氣泡圖（見圖4）。

圖2 蛋白質PPI網絡圖

表2 靶點信息表

圖3 GO分析圖

2.5 SHXF核心活性化合物與SARS-CoV-2 3CL水解酶和Nsp15蛋白的分子對接結果 一般認為配體與受體對接的結合能越低，發生作用的可能性越大，本研究以結合能≤5.0 kacl/mol為篩選標準［13］。分子對接結果顯示SHXF中槲皮素、β-谷甾醇、山奈酚、豆甾醇等與SARS-CoV-2 3CL水解酶和Nsp15蛋白有較好結合，說明其可能在COVID-19的治療中發揮關鍵作用（見表3，圖5）。

3 討 論

盡管目前在《新型冠狀肺炎病毒診療方案（第七版）》中有瑞德西韋、阿比多爾等抗病毒藥物用于臨床治療，但對于COVID-19的治療仍無特效藥。在此次疫情防治工作中，中醫藥顯示出了其獨特優勢，本研究方劑SHXF為國家抗疫推薦藥方。

圖5 槲皮素、β-谷甾醇與SARS-CoV-2 3CL和Nsp15蛋白的分子對接模式圖

本研究中獲得的SHXF作用靶點的生物學功能主要涉及血管生成、脂多糖介導的信號轉導途徑、缺氧反應等多個生物學過程，涉及的靶點包括IL-6、IL-10、CAV1、VEGFA、Akt1等。其中VEGFA為血管內皮生長因子（VEGF）的一種，是血管內皮細胞特異性的肝素結合生長因子，可在體內誘導血管新生。有研究指出，VEGF能夠促進內皮細胞增生、纖維化，促使單核細胞趨化積聚引發炎癥反應［14］，從而加重病情，表明VEGF可能為引起肺炎患者肺組織血管發生病變的原因。

KEGG富集共得到113條結果，主要涉及甲型流感（Influenza A）信號通路、TLR信號通路、PI3K-Akt信號通路、HIF-1信號通路等。TLR信號通路的Toll樣受體是細胞膜糖蛋白，在早期宿主防御病毒入侵過程中發揮重要作用［15］。病毒感染通過激活多種模式識別受體（PRRS）以誘發的抗病毒反應，如激活TLRs等，在甲型流感病毒感染期間，通過TLR7/8識別病毒ssRNA，TLR3課識別病毒dsRNA，在早期抗病毒反應中起著關鍵作用［16］。PI3K-Akt信號通路的PI3K是一種胞內磷脂酰肌醇激酶，參與細胞增殖、分化、凋亡和葡萄糖轉運等多種細胞功能的調節?，F已報道有許多病毒可誘導PI3K途徑，如SARS冠狀病毒、流感病毒、EB病毒、乙型肝炎病毒等，它們都能利用PI3K信號轉導通路為自身的復制增殖提供有利條件［17］?；罨蟮腜I3KAkt通路不僅參與高效的病毒復制和傳播，還可以調節抗病毒的功能［18］。HIF-1信號通路由缺氧誘導因子-1誘導激活，可能與COVID-19患者普遍存在缺氧、呼吸困難的病理表現有相關性。

本研究從網絡藥理學的角度對SHXF的化合物、作用靶點、作用通路以及藥方中的活性成分與SARSCoV-2 3CL水解酶和Nsp15蛋白對接的結合能進行了探索性研究。結果提示SHXF可能通過TLR信號通路、PI3K-Akt信號通路等起到治療COVID-19的作用。同時，本研究基于分子對接技術，對SHXF中主要活性物質與SARS-CoV-2 3CL水解酶及Nsp15進行分子對接，發現SHXF中槲皮素、β-谷甾醇等Vina結合能與西藥瑞德西韋相當或更好，為臨床篩選治療COVID-19的有效中藥提供了思路。但本研究主要依托數據庫，通過數據挖掘對中藥的功能作用進行預測，還需在試驗中進一步證實。