玉蟬衛肺丸對變應性鼻炎大鼠鼻黏膜嗜酸粒細胞、IgE水平及肥大細胞表達的影響*

楊 斌 孫洮玉 劉 真 崔 曄 徐春英△

（1.中國中醫科學院西苑醫院，北京 100091；2.北京中醫藥大學東直門醫院，北京 100700）

變應性鼻炎（AR）是變應原刺激下IgE介導的鼻黏膜非感染性慢性炎癥。流行病學調查顯示，我國城市AR患病率平均為11.1%，全球AR患者人數超過5億［1］。AR如未得到有效控制，可導致鼻竇炎、哮喘等疾病發生［2］，因此對AR患者進行有效干預治療，對防止其惡化具有重要意義。玉蟬衛肺丸是西苑醫院院內制劑，具有補氣健脾散風之功，臨床上取得了較好的療效［3-4］。本研究通過觀察AR大鼠鼻腔分泌物中嗜酸粒細胞數量、血清IgE水平、鼻黏膜組織病理改變以及肥大細胞表達，探究玉蟬衛肺丸對AR的治療作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 32只SPF級SD大鼠，雌雄各半，體質量（200±20）g，4～6周齡，北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，許可證號：SCXK（京）2016-0001。大鼠飼料喂養，自由飲水，室溫（22±2）℃，濕度（55±15）%，并通過本院動物實驗倫理研究委員會同意。

1.2 試藥與儀器 玉蟬衛肺丸，由黃芪、玉竹、蟬衣、防風、白芷組成，生藥量4.25 g/丸，院內制劑號：京衛藥制字（087）第F-1246號。氯雷他定片（西安楊森，10 mg/片，批號：050218967）。卵清蛋白（OVA）（批號A5253-1009，Sigma），氫氧化鋁凝膠［Al（OH）3］（批號A8222-250，Sigma），MC小鼠單克隆抗體（貨號ab2378，Abcam），酶標山羊抗小鼠/兔IgG聚合物（批號1919D0516，中杉金橋）。全自動多功能酶標儀（ASP300，Thermo），全自動脫水機（TP1020，Leica），組織切片機（RM2235，Leiea），光學顯微鏡（BX53，Olymplus），Image-Pro Plus 6.0（Media Cybernetics）。

1.3 分組與造模 1）分組：采用隨機數字表法，32只SD大鼠分為對照組、AR模型組、玉蟬衛肺丸組、氯雷他定組，每組8只。2）造模：除對照組外，其余各組按照文獻方法制備AR大鼠模型：致敏階段給予大鼠腹腔注射卵清蛋白+抗原佐劑混懸液［0.3 mg OVA和30 mg Al（OH）3］溶于1 mL 0.9%氯化鈉溶液，隔日1次，共14 d。激發階段從第15天開始，雙側10% OVA生理鹽水溶液滴鼻，每側50 μL，連續滴鼻7 d。鼻腔激發后30 min內，觀察大鼠噴嚏個數、流涕分泌量及搔鼻次數，采用疊加量化法記錄評分，當評分≥6時，表明造模成功［5-6］。

1.4 干預方法 造模成功后，根據體表面積法換算，玉蟬衛肺丸組劑量500 μg/kg，中藥溶于蒸餾水灌胃，每日1次，氯雷他定組劑量1.25 mg/kg，每日1次，對照組及AR模型組等量生理鹽水灌胃，連續用藥10 d。

1.5 標本采集與檢測 1）Wright染色檢測鼻腔分泌物嗜酸性粒細胞：鼻腔分泌物涂片，95%乙醇固定，蒸餾水洗后平放于染色盒內，滴加Wright染色液覆蓋涂片上細胞區域，再滴加等量緩沖液，輕輕搖動涂片充分混勻，鏡下觀察染色情況，適時蒸餾水沖洗終止反應，再經梯度乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片后備檢。200倍鏡下觀察并統計嗜酸性粒細胞個數。2）ELISA檢測血清IgE水平：末次用藥24 h后，10%水合氯醛腹腔注射麻醉，腹主動脈取血，1 400g離心10 min，分離血清，根據ELISA試劑盒說明書步驟檢測血清IgE水平。3）HE染色檢測鼻黏膜組織形態學改變：處死大鼠，統一取左鼻黏膜組織10%中性甲醛固定，右鼻黏膜組織凍存。組織固定后，常規脫水、包埋、切片，HE染色，顯微鏡下觀察各組鼻黏膜組織病理改變。4）免疫組化檢測鼻黏膜組織內肥大細胞的表達：石蠟切片制作為4 μm厚度，脫蠟至水，檸檬酸鹽緩沖液（pH6.0）高壓熱修復3 min，10% H2O2室溫封閉10 min，PBS洗滌后加入一抗MC，濃度為1∶200，用PBS代替一抗做陰性對照，4℃孵育過夜，二抗室溫孵育30 min，鏡下DAB顯色、蘇木精復染、梯度酒精脫水、封片。在光學顯微鏡200倍下，每切片選取3個高倍視野，拍攝鼻黏膜組織圖像。醫學圖像分析軟件（Image Pro-plus6.0）分析測定每張圖像的積分光密度值。

1.6 統計學處理 應用SPSS17.0統計軟件。計量資料以（）表示。兩組間比較用t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠鼻黏膜嗜酸性粒細胞及血清IgE水平比較 見表1。Wright染色檢測中，嗜酸性粒細胞被染為紅色，其細胞質內可見多量紫紅色嗜酸性顆粒樣物質。與對照組比較，AR模型組大鼠鼻腔分泌物內嗜酸性粒細胞數量增多，血清IgE水平增高（P＜0.05）。各用藥組與AR模型組比較，兩指標均有下調（P＜0.05），其中玉蟬衛肺丸組嗜酸性粒細胞減少較明顯。

表1 各組大鼠鼻黏膜組織嗜酸性粒細胞及血清IgE水平比較（±s）

表1 各組大鼠鼻黏膜組織嗜酸性粒細胞及血清IgE水平比較（±s）

與對照組比較，*P＜0.05；與AR模型組比較，△P＜0.05

組別對照組AR模型組玉蟬衛肺丸組氯雷他定組n 8 8 8 8 EOS（個）3.51±1.07 14.24±3.55*8.02±1.68△9.44±2.24 IgE（μg/mL）40.26±5.61 98.46±11.04*69.72±7.05△73.83±7.96△

2.2 各組大鼠鼻黏膜組織病理學觀察 見圖1。光鏡下，空白組鼻黏膜上皮未見損傷，假復層柱狀纖毛上皮未見變性壞死、增生及萎縮，形態及結構完整，黏膜下層有少數充血，未見炎癥細胞浸潤及腺體增生。模型組鼻黏膜假復層柱狀纖毛上皮明顯增厚，杯狀細胞增多，黏膜下腺體增生擴張，排列紊亂，黏膜下間質大量炎癥細胞浸潤、毛細血管明顯擴張充血。玉蟬衛肺丸組較模型組大鼠鼻黏膜上皮損傷程度明顯減輕，上皮層次較清楚，黏膜下腺體增生不明顯，毛細血管擴張充血，水腫不明顯，少量炎細胞浸潤。氯雷他定組鼻黏膜破損減輕，上皮層次較清楚，黏膜下層腺體輕度減少，毛細血管擴張充血水腫，少量炎性細胞浸潤。

圖1 各組大鼠鼻黏膜組織形態學改變（HE染色，200倍）

2.3 各組大鼠鼻黏膜組織內肥大細胞表達 見圖2。免疫組化結果顯示：肥大細胞胞漿呈黃色至棕黃色陽性顆粒，界限清楚，背景清晰。肥大細胞主要存在于大鼠鼻黏膜組織黏膜及黏膜下層，部分肌層亦見表達，以前二者為主要表達部位。對照組高倍鏡（200倍）視野下平均肥大細胞數為（28.60±4.50）個，與對照組比較，AR模型組大鼠鼻黏膜組織內肥大細胞蛋白表達增高，平均肥大細胞數為（59.60±8.80）個（P＜0.05）；各用藥組與AR模型組比較，肥大細胞數均有不同程度的下調，玉蟬衛肺丸組為（44.80±6.10）個（P＜0.05），氯雷他定組為（48.10±5.30）個（P＜0.05）。

圖2 各組大鼠鼻黏膜組織內肥大細胞表達（免疫組化染色，200倍）

3 討 論

AR為非感染性的免疫炎癥疾病，流行病學調查顯示，全球40%的人口有AR相關癥狀，已成為全球性的健康問題［7］。近年來我國AR患病率急劇上升，標準化患病率從2005年的11.1%上升到2011年的17.6%［8］。

變應性鼻炎屬于Ⅰ型變態反應，機體在外界抗原的刺激下，誘導鼻黏膜或者局部淋巴組織產生過多的IgE，可與相應細胞（主要為肥大細胞）表面的IgE受體結合，活化肥大細胞分泌組胺或白三烯等炎性介質。這些炎癥介質誘導黏膜上皮細胞或者血管內皮細胞分泌細胞因子、趨化分子及黏附分子，不僅造成炎癥的進一步加劇，而且還可以趨化募集并活化嗜酸粒細胞及Th2細胞［9］。最新的研究發現，肥大細胞在AR的發生發展過程中不僅僅是分泌炎癥介質的“效應劑”，它與鼻黏膜上皮細胞［10］以及神經細胞［11］可存在交互作用，在調節上皮細胞完整性及神經敏感性方面都發揮相關作用。因此，血清IgE水平、嗜酸粒細胞及肥大細胞數量均為衡量AR嚴重程度的關鍵指標。筆者實驗顯示：玉蟬衛肺丸和氯雷他定能顯著降低AR大鼠血清IgE水平，抑制嗜酸粒細胞及肥大細胞的活化與增生；同時發現，玉蟬衛肺丸組在降低AR大鼠嗜酸粒細胞及肥大細胞數量方面優于氯雷他定組。

AR主要病理變化為黏膜上皮變性、損傷，黏膜下腺體增生，毛細血管擴張、出血、水腫，神經纖維增生活化及間質炎癥等［12］。其中，上皮、血管及神經病變是造成鼻塞、鼻癢及流涕的病理基礎，而反復炎癥及修復的過程會刺激鼻腔黏膜發生鼻息肉、鼻竇炎。本次實驗發現，玉蟬衛肺丸可以修復鼻黏膜上皮損傷，減緩黏膜下腺體及血管增生，減少水腫，控制炎癥，有效改善鼻黏膜組織損傷，糾正疾病狀態。

AR在中醫學屬于“鼻鼽”范疇，多數學者認為鼻鼽的發生因虛致病者為多，內因多為臟腑功能失調，外因寒邪和異氣之邪為其誘發因素，主要與肺、脾、腎諸臟有關。玉蟬衛肺丸經過中國中醫科學院西苑醫院耳鼻喉科幾代人的臨床驗證，取得了較好療效，得到廣大患者認可。其成分為黃芪、玉竹、蟬蛻、防風、白蒺藜、辛夷、白芷等。方中君藥為黃芪、玉竹，臣藥為蟬蛻、防風，黃芪、玉竹有補益肺脾，提高機體免疫力的作用，蟬蛻、防風、蒺藜可疏散風邪、息風止痙，有抑制免疫與抗過敏作用，全方可改善臟腑功能，外散風邪［13-14］。

綜上所述，玉蟬衛肺丸可以減輕AR大鼠鼻黏膜組織破壞，降低血清IgE水平，減少嗜酸粒細胞及肥大細胞的趨化，顯著改善AR大鼠的炎癥及損傷，初步證明了其對肥大細胞和嗜酸性粒細胞有廣譜抑制活性，可認為其是抵抗抗原誘導的氣道炎癥反應的有效保護劑。本研究提供了玉蟬衛肺丸針對AR西醫學的病因治療的理論基礎。但在AR研究方面仍有許多值得研究的領域，如中藥改善鼻黏膜組織損傷的具體分子機制，抑制肥大細胞活化的作用方式？肥大細胞與鼻黏膜上皮之間是否存在交互作用？這些具體的作用機制還需要我們做進一步的深入研究。