八正散對(duì)急性腎盂腎炎模型大鼠炎癥因子和局部免疫功能的影響*

李碧怡 彭嘉健 鄺敏華 李曠怡 蔡惠鈴

（1.廣東省佛山市中醫(yī)院，廣東 佛山 528000；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東 廣州 510102）

急性腎盂腎炎（APN）是一種由細(xì)菌感染引起的泌尿系統(tǒng)感染性疾病，若不積極治療，可引起膿毒癥、感染性休克，或遷延不愈導(dǎo)致腎衰竭［1］。APN的主要病理基礎(chǔ)是膀胱輸尿管返流細(xì)菌上行，其主要致病菌為大腸桿菌。據(jù)調(diào)查，我國(guó)APN發(fā)病率為0.91%，女性發(fā)病率為2.05%［2］。隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)的發(fā)展，APN致腎衰竭發(fā)病率明顯降低，但是發(fā)病率、復(fù)發(fā)率未明顯下降，嚴(yán)重威脅人類(lèi)的健康。APN以抗生素治療為主，但隨著抗生素濫用導(dǎo)致耐藥性增加，抗感染治療效果不甚理想［3］。APN屬于“淋證”范疇，其病機(jī)為濕熱下注。本課題組臨床運(yùn)用八正散治療APN療效顯著，但是作用機(jī)制尚未闡明。因此，本實(shí)驗(yàn)復(fù)制了APN大鼠模型，采用八正散進(jìn)行干預(yù)，探討其對(duì)APN大鼠的治療作用和機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)SD大鼠60只，雄性，體質(zhì)量（180±20）g，由南方醫(yī)科大學(xué)提供，許可證號(hào)為SCXK（粵）2016-0041。飼養(yǎng)環(huán)境：溫度18～28℃，相對(duì)濕度40%～70%，光照12 h，明暗交替。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 八正散，組成：車(chē)前子15 g，瞿麥15 g，萹蓄 15 g，滑石 30 g，梔子15 g，甘草6 g，通草10 g，大黃10 g。藥材購(gòu)于廣州致信藥業(yè)有限公司，水煎2次并濃縮成每毫升含生藥1.3 g/mL。鹽酸左氧氟沙星片，黑龍江諾捷制藥有限責(zé)任公司，批號(hào)：20190412。

1.3 儀器與試劑 MR-96A酶標(biāo)儀（深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司）；TG-16W離心機(jī)（愛(ài)來(lái)寶（濟(jì)南）醫(yī)療科技有限公司）；Wellwash洗板機(jī)［賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司］；TC-550AP恒溫水浴箱（博勒飛）；ME1002E/02電子天平（梅特勒-托利多國(guó)際有限公司）；分泌性免疫球蛋白A（SIgA）、血肌酐、尿肌酐、降鈣素原（PCT）、超敏C反應(yīng)蛋白（hs-CRP）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、白細(xì)胞介素-10（IL-10）酶聯(lián)吸附反應(yīng)（ELISA）試劑盒（武漢益普生物科技有限公司，貨號(hào)：MM-61503R1、MM-20553R1、MM-0892R1、MM-20265R1、MM-0370R1、MM-0046R1、MM-0195R1、E-EL-R0374）。

1.4 模型制備 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后隨機(jī)分為造模組45只與假手術(shù)組15只。參照文獻(xiàn)［4］制備APN大鼠模型：大鼠禁飲18 h后，2%戊巴比妥鈉腹腔麻醉，仰臥固定，腹部去毛和消毒，下腹部正中切口2 cm，逐層切開(kāi)腹壁，尋找左側(cè)輸尿管后，4號(hào)線從左側(cè)輸尿管兩旁穿出，夾閉陰莖，膀胱注射大腸桿菌液體0.5 mL，逐層縫合腹壁，恢復(fù)飲水和飲食。手術(shù)后24 h拆除輸尿管結(jié)扎線以開(kāi)放輸尿管。假手術(shù)組注射0.5 mL生理鹽水。造模時(shí)間為3 d。APN模型建立成功標(biāo)準(zhǔn)［5］：每立方毫米中尿液白細(xì)胞數(shù)≥100個(gè)。造模組6只大鼠不符合APN標(biāo)準(zhǔn)，3只死亡。

1.5 分組與給藥 將36只APN大鼠隨機(jī)分為模型組、八正散組和抗生素組，每組12只。隨后，按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與人體表面積等效量換算比例［6］計(jì)算大鼠的給藥劑量，八正散組給予八正散12.2 g/（kg·d）灌胃，抗生素組給予鹽酸左氧氟沙星片21 mg/（kg·d）加2 mL生理鹽水灌胃，假手術(shù)組和模型組給予等體積的生理鹽水灌胃。灌胃時(shí)間為14 d。

1.6 標(biāo)本采集與檢測(cè) 1）生化指標(biāo)檢測(cè)。腹主動(dòng)脈采血，3 000 r/min離心15 min，取上清液，采用肌氨酸氧化酶法檢測(cè)血肌酐、尿肌酐，采用ELISA法檢測(cè)SIgA、PCT、hs-CRP、IL-1β、IL-6、IL-10、趨化因子-2（CXCL-2）。留取大鼠尿液，采用肌氨酸氧化酶法檢測(cè)尿肌酐，采用ELISA法檢測(cè)尿SIgA；采用全自動(dòng)血液細(xì)胞分析儀檢測(cè)WBC；試紙條法檢測(cè)尿常規(guī)。2）細(xì)菌學(xué)檢查。無(wú)菌操作下取膀胱尿液，接種于培養(yǎng)基上。取腎臟制備勻漿后接種于培養(yǎng)基上。采用半定量法，細(xì)菌計(jì)數(shù)＞10 000計(jì)為陽(yáng)性，細(xì)菌計(jì)數(shù)＜500計(jì)為陰性。3）大鼠臟器指數(shù)。腹腔麻醉后，摘取腎臟組織和膀胱組織，稱(chēng)濕重，左右腎比值=左腎質(zhì)量/右腎質(zhì)量×100%；腎臟（膀胱）指數(shù)（mg/g）=腎臟（膀胱）質(zhì)量（mg）/體質(zhì)量（g）×100%。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（）表示，采用單因素方差分析和LSD-t檢驗(yàn)進(jìn)行比較，計(jì)數(shù)資料以%表示，采用Fisher精確檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠臟器指數(shù)比較 見(jiàn)表1。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠左右腎比值、腎臟指數(shù)、膀胱指數(shù)顯著升高（P＜0.05）。與模型組比較，八正散組和抗生素組大鼠左右腎比值、腎臟指數(shù)、膀胱指數(shù)顯著下降（P＜0.05）。與八正散組比較，抗生素組大鼠左右腎比值、腎臟指數(shù)、膀胱指數(shù)水平呈下降趨勢(shì)，但差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 各組大鼠臟器指數(shù)比較（±s）

表1 各組大鼠臟器指數(shù)比較（±s）

與假手術(shù)組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與八正散組比較，△P＜0.05。下同

組別假手術(shù)組模型組八正散組抗生素組n 15 12 12 12左右腎比值0.97±0.08 2.93±0.26*1.13±0.14#1.02±0.13#△腎臟指數(shù)（mg/g）4.68±0.35 18.37±2.14*6.12±0.18#5.62±0.23#△膀胱指數(shù)（mg/g）1.25±0.04 4.83±0.21*1.43±0.17#1.35±0.12#△

2.2 各組大鼠細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果比較 見(jiàn)表2。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠尿和腎臟細(xì)菌培養(yǎng)陽(yáng)性率顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，八正散組和抗生素組大鼠尿和腎臟細(xì)菌培養(yǎng)陽(yáng)性率顯著下降（P＜0.05）；與八正散組比較，抗生素組大鼠尿和腎臟細(xì)菌培養(yǎng)陽(yáng)性率顯著下降（P＜0.05）。

表2 各組大鼠細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果比較

2.3 各組大鼠尿白細(xì)胞計(jì)數(shù)、尿隱血、尿SIgA、血清肌酐、尿肌酐水平比較 見(jiàn)表3。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠尿白細(xì)胞計(jì)數(shù)、尿隱血、血清肌酐、尿肌酐水平均顯著升高，尿SIgA水平顯著下降（P＜0.05）；與模型組比較，八正散組和抗生素組大鼠尿白細(xì)胞計(jì)數(shù)、尿隱血、血清肌酐、尿肌酐水平均顯著下降，尿SIgA水平顯著升高（P＜0.05）；與八正散組比較，抗生素組尿白細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯下降（P＜0.05），尿隱血、血清肌酐、尿肌酐水平呈下降趨勢(shì)，但差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表3 各組大鼠尿白細(xì)胞計(jì)數(shù)、尿隱血、尿SIgA、血清肌酐、尿肌酐水平比較（±s）

表3 各組大鼠尿白細(xì)胞計(jì)數(shù)、尿隱血、尿SIgA、血清肌酐、尿肌酐水平比較（±s）

組別n假手術(shù)組模型組八正散組抗生素組15 12 12 12尿白細(xì)胞計(jì)數(shù)（個(gè)/mm3）1.13±0.02 846.26±73.94*34.27±6.24#16.18±2.72#△尿隱血（個(gè)）0.00±0.00 1.93±0.12*0.18±0.02#0.13±0.05#尿SIgA（μg/mL）26.38±3.27 12.31±1.83*24.81±2.34#23.12±2.15#血清肌酐（μmol/L）41.35±6.27 64.23±5.81*50.39±3.12#48.31±5.24#尿肌酐（μmol/L）186.23±15.37 414.31±82.26*226.37±41.18#213.15±46.54#

2.4 各組大鼠血清WBC、PCT、hs-CRP水平比較 見(jiàn)表4。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清WBC、PCT、hs-CRP水平顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，八正散組和抗生素組大鼠血清WBC、PCT、hs-CRP水平顯著降低（P＜0.05）；與八正散組比較，抗生素組血清PCT、hs-CRP水平明顯下降（P＜0.05），WBC水平呈下降趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表4 各組大鼠血清WBC、PCT、hs-CRP水平比較（±s）

表4 各組大鼠血清WBC、PCT、hs-CRP水平比較（±s）

組別假手術(shù)組模型組八正散組抗生素組n 15 12 12 12 WBC（×109/L）7.98±0.34 18.13±2.12*8.62±1.83#8.24±1.75#PCT（ng/mL）0.02±0.00 1.87±0.15*0.11±0.04#0.08±0.02#△hs-CRP（mg/L）1.12±0.08 57.13±8.34*5.43±1.15#3.47±0.24#△

2.5 各組大鼠血清IL-1β、IL-6、IL-10、CXCL-2、SIgA水平的比較 見(jiàn)表5。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清IL-1β、IL-6、CXCL-2水平顯著升高，IL-10、SIgA水平顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，八正散組和抗生素組大鼠血清IL-1β、IL-6、CXCL-2水平顯著降低，IL-10、SIgA水平顯著升高（P＜0.05）；與八正散組比較，抗生素組大鼠血清IL-1β、IL-6明顯下降（P＜0.05），CXCL-2、IL-10、SIgA水平差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表5 各組大鼠血清IL-1β、IL-6、IL-10、CXCL-2、SIgA水平比較（pg/mL，±s）

表5 各組大鼠血清IL-1β、IL-6、IL-10、CXCL-2、SIgA水平比較（pg/mL，±s）

組別假手術(shù)組模型組八正散組抗生素組n 15 12 12 12 IL-1β 19.36±1.42 124.39±29.48*56.72±11.25#45.36±6.41#△IL-6 42.36±5.17 184.36±37.59*69.42±15.34#58.46±12.34#△IL-10 36.79±2.12 11.34±1.94*34.15±5.24#32.31±4.28#CXCL-2 5.13±0.84 10.31±2.15*6.79±1.18#6.10±1.26#SIgA 10.93±0.69 6.12±1.02*11.23±0.85#9.67±1.08#

3 討 論

APN屬于中醫(yī)學(xué)“淋證”范疇，其病因病機(jī)主要為濕熱。濕熱之邪下注，或外感邪，循經(jīng)入腑，與水互結(jié)，蘊(yùn)結(jié)膀胱，膀胱氣化失司，引起尿頻、尿急、尿痛等［7］。因此，淋證急性期以清熱利濕為主要法則。八正散出自《太平惠民和劑局方》，方中瞿麥、萹蓄清熱利濕、利尿通淋，共用為君；通草清心、利小腸、通淋，滑石清熱通淋、利水滲濕，車(chē)前子利尿通淋，諸藥共為臣藥，助瞿麥、萹蓄清熱利濕、利尿通淋。佐以梔子清瀉三焦?jié)駸幔簏S清熱瀉火，導(dǎo)熱下行，給邪以出路。甘草為使藥，緩急止痛，調(diào)和藥性。諸藥合用，共奏清熱利濕、利尿通淋之功。APN主要致病菌為大腸桿菌，大鼠尿培養(yǎng)和腎臟細(xì)菌培養(yǎng)陽(yáng)性是APN診斷的金標(biāo)準(zhǔn)。尿白細(xì)胞計(jì)數(shù)可以直接反映感染的嚴(yán)重程度。肌酐可以反映炎癥對(duì)腎功能的損傷程度。細(xì)菌感染可以導(dǎo)致腎臟、膀胱大量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，纖維組織增生，水腫，因此臟器指數(shù)可顯著升高。本實(shí)驗(yàn)采用左側(cè)輸尿管半結(jié)扎聯(lián)合膀胱注射大腸桿菌方法建立APN模型，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠尿培養(yǎng)陽(yáng)性率、腎臟培養(yǎng)陽(yáng)性率、尿白細(xì)胞計(jì)數(shù)顯著升高，并且腎臟質(zhì)量比、腎臟指數(shù)、膀胱指數(shù)、BLD、尿肌酐、血肌酐、WBC、PCT、hs-CRP、IL-1β、IL-6、CXCL-2水平顯著升高，IL-10、SIgA水平顯著降低。結(jié)果提示APN模型大鼠成功建立，并且APN大鼠出現(xiàn)了輕度腎功能損傷、嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)和尿路局部免疫功能低下。經(jīng)過(guò)八正散干預(yù)后，APN大鼠尿培養(yǎng)陽(yáng)性率、腎臟培養(yǎng)陽(yáng)性率、尿白細(xì)胞計(jì)數(shù)、左右腎質(zhì)量比、腎臟指數(shù)、膀胱指數(shù)、尿白細(xì)胞計(jì)數(shù)、BLD、尿肌酐、血肌酐水平顯著降低。結(jié)果提示八正散具有抑制APN大鼠尿及腎臟細(xì)菌、減輕臟器指數(shù)、改善腎功能的作用。

炎癥反應(yīng)是APN的主要機(jī)制，表現(xiàn)為機(jī)體內(nèi)血清炎性因子水平顯著升高。WBC與炎癥程度呈正比，其水平越高，炎癥反應(yīng)越嚴(yán)重。PCT是一種甲狀腺C細(xì)胞分泌的無(wú)激素活性的降鈣素前肽物質(zhì)，當(dāng)細(xì)菌感染時(shí)血清含量顯著上升，是一種診斷細(xì)菌感染的特異性指標(biāo)。PCT不僅可以反映炎癥的嚴(yán)重程度，而且可以作為判斷疾病進(jìn)程和預(yù)后的重要指標(biāo)，并且可以指導(dǎo)抗生素的使用［7-8］。hs-CRP是一種肝臟分泌的急性期感染性蛋白，其水平越高提示感染越嚴(yán)重。CXCL-2是一種趨化因子，當(dāng)細(xì)菌感染腎臟后，分泌的脂多糖通過(guò)與Toll樣受體結(jié)合后刺激局勢(shì)細(xì)胞分泌CXCL-2，引發(fā)炎癥，而且可以趨化中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等聚集浸潤(rùn)，加重局部炎癥反應(yīng)［9-10］。CXCL-2還可以通過(guò)核轉(zhuǎn)錄因子促進(jìn)IL-1、IL-6等炎性因子的釋放，導(dǎo)致炎癥瀑布級(jí)聯(lián)反應(yīng)。IL-1和IL-6可以促進(jìn)巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞分泌炎性因子，形成級(jí)聯(lián)反應(yīng)，而且可以刺激趨化因子表達(dá)，還可以導(dǎo)致腎臟纖維化［11］。IL-10是一種抑炎因子，可以抑制巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞等分泌炎性因子，減輕炎癥，而且可以抑制T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)［12-13］。經(jīng)過(guò)八正散干預(yù)后，APN大鼠WBC、PCT、hs-CRP、IL-1β、IL-6、CXCL-2水平顯著降低，IL-10水平顯著降低。結(jié)果提示八正散具有抑制APN大鼠炎癥反應(yīng)的作用。

SIgA是一種膀胱和尿道上皮細(xì)胞分泌的免疫球蛋白，是泌尿系體液免疫的重要組成部分。正常情況下，當(dāng)尿路受到細(xì)菌感染時(shí)，其SIgA水平顯著升高，從而凝集細(xì)菌，防止細(xì)菌黏附于上皮細(xì)胞［14-15］。而APN大鼠免疫功能低下，其尿道分泌SIgA不足［16］。經(jīng)過(guò)八正散干預(yù)后，APN大鼠尿SIgA水平顯著升高。結(jié)果提示八正散具有加強(qiáng)腎盂腎炎大鼠尿道局部免疫功能的作用。

綜上，八正散可以抑制APN大鼠的炎癥反應(yīng)，提高局部免疫功能，抑制細(xì)菌生長(zhǎng)。