警報素S100A8/A9對骨關節炎相關細胞影響的研究進展

周松，蔡敏，李興艷，黃克，項征，詹和龍，焦品一

(1.廣西醫科大學第三附屬醫院骨科，廣西 南寧 530031；2.安徽省滁州市安徽涵博健康集團醫院，安徽 滁州 239000)

隨著老齡化人口的增加，骨關節炎(osteoarthritis，OA)現已成為是全世界最常見的慢性炎癥性關節疾病，其影響不僅局限于某個地區，而是對全球的成年人都有著深遠影響。進入21世紀以后，OA的發病人數更是逐年上漲。它是發達國家十大致殘性疾病之一，對社會產生很大的經濟負擔。OA是一種高度異質性的疾病，影響所有滑膜關節，主要特征是關節軟骨的進行性降解以及繼發性滑膜炎和骨重塑，使患者出現關節疼痛、僵硬、行動能力降低、畸形等諸多臨床問題。發展成OA的最主要危險因素就是年齡。近年來，國外學者發現警報素S100A8/A9在骨關節炎的發病過程中扮演者重要的角色，且S100A8/A9隨著年齡的增長而分泌增多，但國內卻缺少關于S100A8/A9與OA之間的相關研究。本文主要總結了近年來國外學者研究發現的S100A8/A9與參與骨關節炎發生、發展進程中相關細胞之間的相互關系。

1 OA的概述

OA是全世界最常見的慢性炎癥性關節疾病，影響全球10%～15%的成年人，已成為一種快速發展的現代疾病[1]。在1990—2016年期間，觀察到OA患病率由14.05‰增加到30.16‰，致殘存活人數由和730萬增加到1 630萬[2]。它是發達國家十大致殘性疾病之一，對社會產生很大的經濟負擔，估計社會成本在國內生產總值的1.0%～2.5%[3]。早在2008年，有癥狀的OA已成為美國醫院治療費用最高的疾病之一，通過關節置換術住院治療的全國費用高達到約400億美元[4]。

OA的主要特征是關節軟骨的進行性降解以及繼發性滑膜炎和骨重塑[5]。在OA的發展過程中，整個關節的代謝和結構逐漸改變，軟骨受損、軟骨下骨重塑和滑膜的慢性炎癥[6-7]。發展成骨關節炎的主要危險因素是年齡、肥胖、代謝性疾病、性別、種族、營養、吸煙、骨密度、肌肉功能、關節創傷和不穩[8]。目前對于OA仍沒有有效的治療手段。根據OA的階梯治療原則[9]，首先建議超重和肥胖患者的減輕體重以降低癥狀性骨關節炎的風險。目前OA的藥物治療旨在減輕疼痛和緩解炎癥，包括氨基葡萄糖和軟骨素作為補充劑使用，阿司匹林和布洛芬被用于減輕炎癥和疼痛，以及關節內注射局部給予皮質類固醇減少促炎介質的產生和單個核細胞的浸潤[10]。OA的終末治療仍然是關節置換手術。雖然OA可以通過關節置換得到有效的治療，但也加重了患者的經濟負擔，并且患肢功能的改善和假體的壽命是有限的[11]。

在OA的進展過程中，軟骨發生的病理改變包括氧化應激、炎癥、細胞凋亡、基質丟失和自噬。在OA中，炎癥細胞因子如白細胞介素(interleukin，IL)-1β通過刺激軟骨細胞和滑膜細胞中活性氧(reactive oxygen species，ROS)和一氧化氮(NO)的產生而增加氧化應激，導致軟骨基質的合成和分解代謝失衡，導致軟骨丟失[12]。小鼠模型的研究表明，生長因子，如轉化生長因子(transforming growth factor，TGF)-β、wnt3a，以及信號分子，如β-catenin、Smad3和HIF-2α，參與OA的進展[7，13]。近年來，國外學者發現警報素S100A8/A9在骨關節炎的發病過程中扮演者重要的角色，但國內卻缺少關于此方面的相關研究。

2 警報素S100A8/A9的概述

警報素S100A8/A9也稱為鈣保護素或MRP8/14，是一種小的鈣結合蛋白。它們屬于S100家族，于1965年首次作為神經蛋白從牛腦中提取出來。S100A8/A9主要由中性粒細胞和單核細胞釋放，它們通常以異二聚體的形式存在[14]。S100A8/A9作為Ca2+感受器在中性粒細胞和單核細胞中組成性表達，參與細胞骨架重排和花生四烯酸代謝。存在于中性粒細胞、單核細胞、激活的巨噬細胞、角質形成細胞、上皮細胞以及破骨細胞的細胞質中。和所有的警報素一樣，S100A8/A9 發揮著各種細胞內功能。在炎癥和組織損傷過程中，S100A8/A9被釋放到細胞外環境中，從而警報免疫系統。S100A8和S100A9都具有帶電荷氨基酸殘基的螺旋-環-螺旋序列，使得它們對Ca2+和Zn2+等二價離子具有高親和力[14]。與二價離子結合改變了S100A8/A9的構象，從而發揮其相應的功能。人S100A8/A9形成異二聚體，甚至是更高的寡聚形式。最近報道了S100A8和S100A9的四聚體。四聚體的形成嚴格依賴于鈣的存在，在沒有鈣的情況下，異源二聚體是人S100A8/A9的主要形式。近來發現S100A8/S100A9通過影響調節不同的細胞在OA中發揮作用，如：軟骨細胞、單核細胞、巨噬細胞、中性粒細胞和破骨細胞。下文將從這些細胞與S100A8/S100A9之間的關系分別闡述。

3 警報素S100A8/A9與參與骨關節炎病程的相關細胞

3.1 S100A8/A9與軟骨細胞 在以往的研究中，用S100A8/A9刺激OA軟骨細胞可以上調分解代謝標志物，如：基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)(MMP-1、MMP-3、MMP-9和MMP-13)、白細胞介素(interleukin，IL)(IL-6、IL-8)和單核細胞趨化蛋白1，下調合成代謝標志物(聚集蛋白聚糖和II型膠原)，從而使軟骨破壞[15]。例如，在最近對160例臨床膝關節OA患者的研究中發現，IL-8不僅參與軟骨細胞的破壞，還與膝關節癥狀、髕下脂肪墊信號強度改變以及骨和/或軟骨生物標志物的血清水平呈正相關[16]。IL-8通過誘導一系列致病過程，如：(1)釋放基質降解金屬蛋白酶；(2)中性粒細胞聚集；(3)白細胞激活并歸巢于滑膜；(4)誘導軟骨細胞肥大和分化；(5)血管生成功能，在OA中持續發揮炎性作用[16]。S100A8/A9刺激軟骨細胞產生基質金屬蛋白酶，從而使周圍的細胞外基質降解，并形成正反饋環驅動OA的發展[17]。軟骨細胞通過增加包括MMPs(MMP-2、MMP-3、MMP-9和MMP-13)、具有凝血酶反應蛋白基序的去整合素和金屬蛋白酶(a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs，ADAMTS)-4和ADAMTS-5在內的基質降解酶的產生，以及軟骨細胞表達的晚期糖基化終產物受體(receptors for advanced glycation end products，RAGE)和Toll樣受體(Toll-like receptor，TLR)-4通過非依賴性途徑中的ADAMTS-4和ADAMTS-5，以適應細胞外S100A8/A9刺激[18]。在MMPs中，MMP-3直接參與破壞Ⅱ型和Ⅸ型膠原端肽的膠原交聯，導致纖維結構和功能的破壞[19]。MMP-10具有與MMP-3相似的結構和底物特異性，可以激活與軟骨老化相關的原膠原酶；而MMP-13是一種在關節軟骨II型膠原降解中起重要作用的酶[15]。在OA中，S100A8/A9可以直接刺激軟骨細胞產生MMP-3和MMP-13[18]，血清MMP-3、MMP-10和MMP-13也有正相關性[16]。所以S100A8/S100A9可能通過上調這些MMPs的表達在軟骨損傷中發揮作用。

3.2 S100A8/A9與單核細胞 單核細胞是整個炎癥性OA過程中滑膜內的主要炎癥細胞[12]。小鼠中存在Ly6C高水平和Ly6C低水平兩種類型的非經典巡邏單核細胞[20]。小鼠Ly6C高水平和Ly6C低水平與的人類經典CD14+CD16-和非經典CD14+CD16+相對應。Ly6C高水平單核細胞表達高水平的C-C趨化因子受體2(C-C chemokine receptor 2，CCR2)并在C-C趨化因子配體2(C-C chemokine ligand 2，CCL2)的引導下參與清除組織碎片，主要產生促炎細胞因子如IL-1β和S100A8/A9。相反，Ly6C低水平單核細胞表達高水平的CX3C趨化因子配體1(CX3C chemokine ligand 1，CX3CL1)并被CX3C趨化因子受體1(CX3C chemokine receptor 1，CX3CR1)吸引，釋放合成代謝因子如血管內皮生長因子和TGF-β，參與關節組織的修復[20]。滑膜內Ly6C高水平單核細胞和Ly6C低水平單核細胞之間的相對數量和相互作用決定了炎癥的嚴重程度，并調節組織病理變化的進一步發展。Cremers等[17]利用野生型C57BL/6(WT)和S100A9基因缺陷小鼠誘導膠原酶誘導的OA(collagenase-induced OA，CIOA)后，向關節內注射S100A8，用酶聯免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)和逆轉錄定量聚合酶鏈式反應(reverse transcription-quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR)檢測滑膜中單核細胞標志物、促炎細胞因子和趨化因子的表達。研究發現在整個CIOA過程中，S100A8和S100A9的mRNA水平明顯增強；免疫定位顯示S100A8/A9蛋白由炎癥滑膜襯里內的單核細胞強烈表達[17]。相比之下，IL-1β、IL-1α和IL-6僅在早期升高[21]，研究表明CIOA中的滑膜炎癥是由S100A8/A9所主導。S100A8/A9形成的異源二聚體與TLR4結合刺激附近的滑膜細胞釋放趨化因子，吸引單核細胞聚集[22]。骨髓中的髓系前體細胞在生長因子如PU.1和巨噬細胞集落刺激因子(macrophage colony-stimulating factor，M-CSF)的驅動下分化為Ly6C高水平單核細胞。局部炎癥促進Ly6C高水平單核細胞從骨髓釋放到循環中，在循環中它們保持該狀態或轉化為Ly6C低水平單核細胞[23]。CCL2的高水平，吸引更多Ly6C高水平單核細胞在滑膜聚集。此外，S100A8/S100A9更有利于炎癥滑膜中Ly6C高水平單核細胞的存在，不僅通過趨化吸引，并通過抑制其向Ly6C低水平細胞的分化，從而維持更多的單核細胞群體進入促炎癥狀態[17]。Ly6C高水平單核細胞是S100A8/A9的有效生產者，使單核細胞群體保持在促炎狀態并形成正反饋回路。

3.3 S100A8/9與巨噬細胞 OA的進展實際上是由試圖修復受損組織的慢性炎癥所驅動。OA的主要標志是多種類型的巨噬細胞，雖然OA中滑膜巨噬細胞較少，但它們對促炎細胞因子的產生至關重要。近來Fahy等[24]通過研究證實，OA滑膜中同時存在M1樣巨噬細胞和M2樣巨噬細胞，即用經典激活的M1和交替激活的M2巨噬細胞[25]。炎癥階段，巨噬細胞的特征是由生成炎癥介質如組織壞死因子-α、干擾素-γ或病原體相關分子模式介導激活經典激活M1巨噬細胞[26]，M1巨噬細胞一旦被激活，這些巨噬細胞本身就會釋放促炎細胞因子[IL-1、IL-6、IL-12、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)]和其他組織損傷信號[25-26]。M2巨噬細胞表型與清除完成后的修復有關[25]。被IL-4和IL-13激活的M2細胞(或替代激活途徑)釋放生長和血管生成因子，如轉化生長因子-β、血管內皮生長因子和表皮生長因子，并調節T細胞功能，促進受損組織的重塑[26]。van den Bosch等[27]發現耗盡巨噬細胞的OA滑膜細胞培養物不再產生炎癥因子，用S100A9刺激巨噬細胞可以增加各種促炎因子和分解代謝因子表達。這表明巨噬細胞是調節OA滑膜激活中促炎因子釋放的主要細胞類型，而S100A9是巨噬細胞的有效激動劑。此外，粒-巨噬細胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，GM-CSF)分化的巨噬細胞更是S100A8/A9優先由表達和產生者[27]。在OA中，由GM-CSF分化的巨噬細胞產生的S100A8/A9可以極大程度上刺激GM-CSF分化的巨噬細胞和較小程度的刺激M-CSF分化的巨噬細胞來誘導OA滑膜中的促炎環境，從而也形成一個正反饋環，這可能是OA過程中關節破壞的重要原因之一。但是當Manferdini等[28]用脂肪間充質基質細胞將M1巨噬細胞向M2巨噬細胞轉變后，打破此正反饋環，S100A8和S100A9表達均明顯減少。這也逆向證明了S100A8/9與巨噬細胞存在明顯相關性。

3.4 S100A8/9與中性粒細胞 中性粒細胞是最早被招募到炎癥部位的細胞之一，通過部署復雜的抗菌策略，包括煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶產生ROS，在脫顆粒過程中釋放細胞毒性產物，以及形成中性粒細胞外陷阱，在炎癥早期中起關鍵作用。中性粒細胞也能夠分泌一系列令人印象深刻的自分泌和旁分泌介質，包括細胞因子和趨化因子，這些細胞因子和趨化因子可以招募其他免疫細胞并調節它們的功能。在抗原誘導形成的關節炎小鼠模型中，關節中性粒細胞的數量與骨侵蝕的量之間存在著強烈而顯著的相關性[29]。中性粒細胞是alarmin S100A8/A9的強大生產者。S100A8和S100A9能強烈促進多種促炎細胞因子產生并參與到OA病程中來，如IL-6、IL-8、趨化因子單核細胞趨化蛋白1、MMP-1、MMP-3、MMP-9和MMP-13，其主要受體為TLR-4[30]。一旦在細胞外環境中釋放，S100A8和S100A9通過激活中性粒細胞(自分泌作用模式)或其他炎癥細胞類型(旁分泌作用模式)，通過多的功能促進炎癥過程的放大。在中性粒細胞內，Ca2+依賴性S100A8/A9異四聚體的形成可能是其生物活性的前提條件，這似乎受到S100A9翻譯后修飾的調節。事實上，S100A9可以在激活的中性粒細胞和單核細胞中被p38MAPK在Threonin 113處磷酸化，并且這種磷酸化有助于微管重組和吞噬細胞遷移，而且還調節中性粒細胞NADPH氧化酶[31]。然而，分泌的S100A9的磷酸化狀態以及這種磷酸化對S100A8/A9胞外活性的影響尚未被研究。最近研究指出，S100A9是中性粒細胞以磷酸化形式分泌的[32]。S100A9的磷酸化是S100A8/A9微管網絡的調節因子，隨意磷酸化S100A9的可以調節有效地從中性粒細胞分泌S100A8/A9[31]。S100A8/A9觸發中性粒細胞趨化因子以及TNF-α的釋放，中性粒細胞通過放大衍生的細胞因子和趨化因子的產生而發揮強大的自分泌作用[31]。因此，細胞外S100A8/A9可能協調免疫細胞向炎癥部位的募集，也有助于炎癥反應的持續進行。

3.5 S100A8/9與破骨細胞 OA是一種以軟骨破壞、軟骨下骨改變、骨贅形成等病理狀態為特征的關節疾病，其中以軟骨破壞為中心[33]。破骨細胞有著獨特的吸收骨組織的能力，與成骨細胞和骨細胞一起，是整個骨轉換過程中的關鍵。在OA中破骨細胞是一種重要的骨、軟骨破壞因子[34]。降解軟骨下骨和軟骨所需的破骨細胞激活的吸收過程在重構骨關節炎過程中起著及其重要的作用[35]。

在Grevers等[36]早期的研究分析了S100A9基因缺陷小鼠和野生型對照小鼠關節炎中膝關節的破骨細胞的表達和骨破壞情況。研究表明在破骨細胞形成過程中添加S100A8會刺激破骨細胞的形成[36]。對于破骨細胞而言，肌動蛋白環的形成與其骨吸收的能力有密切的相關性[37]，而S100A8可以促進肌動蛋白環的形成，即增加了破骨細胞骨吸收的能力。S100A8是TLR-4的內源性配體[30]，誘導髓樣分化因子88的細胞內易位，并激活IL-1受體相關激酶和核因子-kappa B(nuclear factor-kappa B，NF-KB)，對破骨細胞分化和功能至關重要[38]。但當阻斷S100A8與TLR-4受體的結合，則可以完全抑制破骨細胞數量的增加和骨吸收的增強[36]。

雖然S100A8/A9先前已被認為與骨吸收增加以及成熟破骨細胞分化和活化激活有關，但在最近的體外細胞培養研究中，Di等[39]卻首次發現將破骨細胞前體暴露于S100A9會抑制其破骨潛能。核因子受體激活劑-kB(receptor activator of nuclear factor-kappa B，RANK)配體信號通路通過與RANK受體結合而參與破骨細胞的生存、增殖、分化和激活[40]。缺乏編碼RANK的TNFRSF11A基因的特征是破骨細胞分化受阻導致嚴重的骨化病，而阻斷RANKL-RANK與抗體的相互作用則可以有效地減少破骨細胞介導的骨吸收[41]。S100A9通過直接降低了RANK編碼基因TNFRSF11A的表達及其下游信號傳導，阻礙單核破骨細胞前體分化為破骨細胞[39]。實際上在人體中，巨噬細胞在S100A9作用下會增加各種促炎癥因子的表達，如IL-1b、IL-8和TNF-a，而這些促炎介質能刺激破骨細胞分化和活性，因此S100A9有著促進破骨的作用[27]。因此S100A8/A9的抑制作用被認為是對成熟破骨細胞的促炎和刺激作用的負反饋環，為防止在無菌炎癥條件下發生不受控制的骨吸收現象[39]。

綜上所述，OA目前是世界范圍內面臨的重要臨床問題。OA高致殘率使得整個社會的醫療負擔明顯加重。雖然關節置換是目前最有效的治療方案，但卻不能解決所有的問題。目前研究發現在OA的病程中警報素S100A8/A9扮演者重要的角色，并且與OA發病的相關細胞(軟骨細胞、單核細胞、巨噬細胞、中性粒細胞和破骨細胞)都有著明顯的相關性。在國外，S100A8/A9現已成為OA病情監測和治療的熱點。而隨著中國逐步邁入老年社會，OA的患者也會逐年上漲，這就需要我們更加深入的去研究OA發病與治療，以尋求一個更好的治療方案。