氧化應激在心肌缺血再灌注損傷中的研究進展

李思源，劉振兵

1 內蒙古醫科大學，呼和浩特010100；2 內蒙古醫科大學鄂爾多斯臨床醫學院 鄂爾多斯市中心醫院

在全球范圍內，急性心肌梗死的發病率和病死率居高不下，隨著治療技術的不斷進步，再灌注治療使得急性心肌梗死患者的病死率明顯下降。但再灌注后發生的氧化應激（OS）會誘發心肌缺血再灌注損傷（MIRI）進而導致細胞死亡［1］。MIRI 在臨床與基礎實驗轉換中仍存在許多問題［2］。探討OS 在MIRI 中的發生及作用機制，可為MIRI 的治療和開發相關藥物提供參考及思路。現將近年OS 在MIRI中的研究進展綜述如下。

1 OS在MIRI中的作用

正常生理情況下，體內各種氧化劑和抗氧化防御系統之間存在相互作用，使得體內氧化劑與抗氧化防御系統處于動態平衡中，心肌缺血再灌注過程中氧化劑產生過多導致其與抗氧化防御系統的動態平衡被打破，從而造成氧化劑和抗氧化防御系統的不平衡，稱為 OS［3］，其主要是 ROS 形成與酶和非酶抗氧化劑之間不平衡的結果。OS 是由自由基在體內產生的一種負面作用，并被認為是導致衰老和疾病的一個重要因素。OS 通常與細胞和亞細胞水平中ROS 或活性氮（RNS）含量升高有關，他們在MIRI過程中起重要作用，其中ROS 作用更加廣泛。ROS是一組短壽命的低相對分子質量化合物，是由氧經歷的各種反應衍生而來，ROS包括超氧陰離子（O2·-）、羥基自由基（·OH）、過氧化氫（H2O2）、單態氧（O-）和次氯酸（HClO）［4］。ROS 被認為是細胞代謝、增殖、分化、免疫系統調節和凋亡的重要介質，生理狀態下，ROS維持在較低水平作為信號分子發揮作用。在病理生理條件下，ROS的主要來源包括MIRI過程中的線粒體呼吸電子傳遞鏈、黃嘌呤氧化酶（XO）、NADPH 氧化酶系統、解偶聯的一氧化氮合酶（NOS）系統與其他酶原系統［5］。

2 MIRI中ROS的產生途徑

2.1 線粒體途徑 在MIRI 中OS 反應主要由ROS介導，線粒體是ROS 的主要來源，而線粒體中呼吸鏈復合體Ⅰ和Ⅲ是構成線粒體來源ROS 的重要部分之一［6］。線粒體負責細胞能量的產生，當線粒體進行氧化磷酸化被干擾時，會導致ROS 生成速率增強，這一過程不僅減少了細胞能量生成（減少ATP的產生），而且導致ROS的產生傾向增大［7］。當線粒體感知到細胞內的OS會啟動應激信號的釋放，導致膜去極化、腺嘌呤核苷酸水平改變、ROS 產生、Ca2+超載和mPTP 開放。但在正常生理狀態下線粒體中存在多種抗氧化機制來抵消ROS 的作用，從而減少其對細胞的損傷。當缺血器官血液供應重新恢復時，氧氣大量涌入會加劇ROS 的產生，影響線粒體中呼吸鏈的正常運作，并破壞膜成分中的DNA、蛋白質和脂質，最終導致線粒體功能障礙，引起細胞和組織的功能障礙進而導致細胞死亡［8］。

2.2 NADPH 氧化酶（NOX）途徑 NOX 是能調節ROS 產生的特殊功能酶，NOX 所產生的ROS 起第二信使的作用，參與調節細胞分化、增殖和凋亡，其中NADPH 氧化酶 2（Nox2）和 NADPH 氧化酶 4（Nox4）亞型在調節心肌細胞的發育中起重要作用。再灌注期間，當O2重新灌注到缺血部位，會引起NOX的上調和激活，進而產生ROS［9］。ROS可通過介導中性粒細胞的浸潤，進一步使NOX活化促使ROS的產生。

2.3 髓過氧化物酶（MPO）途徑 MPO 是一種中性粒細胞和單核細胞酶，通過產生次氯酸、自由基和RNS 來增強H2O2的反應性。 髓過氧化物酶在中性粒細胞呼吸爆發時，需血紅素作為輔助因子并從H2O2和氯離子的反應中產生次氯酸。一氧化氮與氧或氧相關的反應中間體（如超氧化物）相互作用能產生大量的 ROS和 RNS［10］。

2.4 其他產生途徑 在局部缺血期間，ATP被逐步分解為次黃嘌呤，次黃嘌呤在組織中積累，黃嘌呤脫氫酶通過蛋白水解機制轉化為黃嘌呤氧化酶，缺血組織中存在過量的必需底物次黃嘌呤和黃嘌呤氧化酶，但由于缺乏為反應提供燃料的氧分子，次黃嘌呤氧化為黃嘌呤和尿酸的反應無法進行。再灌注時，該必需的底物突然重新提供給組織，從而加劇ROS的快速過量產生。缺血再灌注過程中，細胞內H+、Ca2+的積累及線粒體膜電位的破壞亦導致ROS 的形成［11］。研究表明，殘留 O2的存在是缺血期間 ROS 生成的關鍵因素，由于電子漏出增多，線粒體電子傳遞鏈受損被認為有助于殘留O2向O2·-轉化。

3 MIRI過程中氧化應激介導損傷的途徑

3.1 ROS 介導途徑 OS 是再灌注損傷的重要標志，其通過產生ROS 誘導細胞損傷，甚至死亡。及時的再灌注對于減輕缺血性損傷和挽救可存活的心肌至關重要，但其可促進心肌細胞的損傷。盡管ROS在缺血再灌注（I/R）中的確切作用仍不明確，但在I/R 細胞損傷的起始過程中得到認可。過量的ROS在MIRI損傷中起重要作用，積累的ROS除激活應激反應的通路外，與膜磷脂脂肪酸反應，會直接破壞細胞膜磷脂雙分子層，導致膜各組分比例失常，影響膜流動性、細胞器、膜通透性、離子通道、膜結合酶等的生理功能，引起細胞不可逆損傷，并且脂質過氧化會引起線粒體和肌膜的不穩定使非特異性小分子進入膜內，導致線粒體基質腫脹和凋亡；還可導致蛋白質變性，并直接對DNA 造成損傷，特別是線粒體DNA，通過破壞核酸的核糖，干擾其復制，影響蛋白質正確合成，導致細胞死亡；甚至還能降解位于細胞間隙中的成分，通過增加細胞膜的通透性，導致組織水腫，繼而影響物質的轉運、信號傳遞等功能［12］。這種非特異性損傷啟動細胞因子介導的級聯反應，導致腫瘤壞死因子α（TNF-α）的產生。過量的TNF-α表達和隨后的心肌細胞腫瘤壞死因子α1型受體刺激會導致收縮功能障礙、肥大、纖維化和細胞死亡［13］。

OS的嚴重后果之一還有mPTP的開放，mPTP主要維持線粒體膜電位及細胞內外的離子平衡，通常不被離子和蛋白質滲透，對于維持線粒體的結構和功能有重要作用。雖然短暫的mPTP 開放參與心臟保護，但長期開放會導致細胞生物學中不可逆轉的變化和細胞死亡，這是由于促凋亡因子的釋放所致。缺血期間細胞的酸性環境會阻止mPTP 的開放和心肌細胞過度收縮，再灌注期間ROS 通過誘導mPTP 的開放，使線粒體腫脹、破裂并導致促凋亡因子釋放從而啟動細胞死亡信號傳導通路，ROS 還可誘導產生更多ROS進一步加劇損傷［9］。

線粒體作為ROS 產生的主要場所，在氧化應激反應中有多種途徑產生ROS 進而促進氧化損傷，如硫氧還蛋白互作蛋白（TXNIP）從細胞核穿梭到線粒體，硫氧還蛋白2（Trx2）在線粒體中調節線粒體ROS的產生和線粒體凋亡信號通路。Trx2通過減少半胱氨酸氧化形成的二硫鍵來修復可逆的氧化蛋白損傷，硫氧還蛋白通過二硫鍵與Trx2 結合，抑制Trx2的還原功能。TXNIP與Trx2的相互作用促進線粒體ROS 的產生，觸發線粒體凋亡信號通路，導致I/R 損傷。OS 會損害細胞器，如內質網和線粒體，從而促進Ca2+離子和促凋亡蛋白釋放到細胞質中，從而增強細胞凋亡途徑。硫氧還蛋白互作蛋白介導這些生物過程，并通過其促氧化作用促進組織的氧化損傷。

3.2 NO 途徑 在心肌缺血再灌注過程中，OS 過程存在不同途徑介導的氧化損傷，如超氧化物與一氧化氮（NO）快速反應形成具有高度反應性的中間體過氧亞硝酸鹽（ONOO-）。隨著細胞內酸化的增加，ONOO-變得更加質子化，形成過氧亞硝酸（ONOOH），然后迅速轉化為二氧化氮（NO2）和·OH。ONOO-/ONOOH 成為強細胞毒性氧化劑，引起氧化損傷。過量的NO 還可通過多種途徑激活線粒體凋亡，從而誘導OS［14］。

4 MIRI中氧化應激與其他途徑的相互作用

4.1 氧化應激觸發促炎反應 ROS 不僅通過自身造成MIRI，還可通過促進其他途徑引起MIRI。當細胞暴露于高水平的ROS 時會觸發炎癥級聯反應和黏附分子的表達，如通過使核因子κB（NF-κB）激活，觸發促炎反應，其特征是TNF-α、IL-1β、IL-6 和IL-8 水平升高，黏附分子（如VCAM-1 和ICAM-1）的表達增加，從而促進OS［15］。炎癥級聯反應的發生和黏附分子的表達會導致白細胞（特別是嗜中性粒細胞）堵塞心臟毛細血管并使得毛細血管內皮腫脹，從而阻礙毛細血管內血液流動，這對血管運作起負性作用［19］。在炎癥級聯反應觸發后，誘導型一氧化氮合酶（iNOS）被炎癥介質激活，使iNOS 解偶聯成為引起心肌OS的主要貢獻者。

4.2 氧化應激引發細胞凋亡 ROS 水平增加可使金屬蛋白酶和鈣蛋白酶的激活，有助于細胞膨脹和溶解。可使mPTP 開放且會導致線粒體腫脹和線粒體外膜破裂，從而有利于促凋亡因子的沉積和SMAC/Diablo從膜間間隙進入細胞質，進而引發細胞凋亡［16］。線粒體誘發的細胞凋亡受Bcl-2家族蛋白的調控，位于線粒體外膜中，Bcl-2家族蛋白控制線粒體膜的通透性，然后調節細胞色素C（Cyt c）的釋放。他們可在功能上分為促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白。前者包括Bad、Bax、Bak、Bid、Bim、Puma 和BNIP3；而后者包含 Bcl-2、Bcl-x、Bcl-xL 和 BAG。在 Bcl-2 家族蛋白中，Bax 可在細胞核或線粒體（np53 或mp53）中被抑癌蛋白 p53 上調；而 Bcl-2 或 Bcl-xL 可阻斷 np53 或mp53介導的細胞凋亡，當p53的表達受到抑制時，心臟組織中的Bax和Caspase-3被下調［17］。Cyt c是一種信號分子，在細胞應激過程中從線粒體釋放到胞質中。在胞質中，Cyt c 可結合并激活Apaf-1和proCaspase-9，隨后導致Caspase-9激活，進而促進Caspase-3和Caspase-7的激活［18］。

4.3 氧化應激誘導鈣超載 OS 不僅可損傷線粒體，還可損傷內質網，從而促進Ca2+和促凋亡蛋白釋放至細胞質中，增強凋亡途徑。OS可能在誘導細胞內Ca2+超載中發揮關鍵作用，過量ROS 觸發的線粒體OS 會加速線粒體功能失常，降低線粒體能量供應，破壞鈣穩態，導致線粒體鈣超載［19］。ROS可通過影響興奮—收縮耦合的核心蛋白，包括L-型鈣通道、鈉通道、鉀通道和鈉—鈣離子交換器，直接損害心肌細胞的電生理和收縮機制。 ROS 還可改變肌漿網Ca2+-SERCA 的活性，并降低肌絲鈣的敏感性。此外，ROS 通過影響參與能量代謝的蛋白質的功能而導致能量不足。MIRI 導致ROS 的積累從而引起OS，對心肌造成不利影響：①ROS 增加嚴重影響心肌細胞的電生理。ROS 逆轉Na+/Ca2+交換器（NCX）的功能，導致Ca2+流入和Na+流出。ROS 還通過L-型鈣通道增加Ca2+的內流。②過量的ROS 促進RyR2活性，抑制肌漿網Ca2+-SERCA2 活性，導致鈣超載，降低肌絲鈣敏感性，最終導致收縮功能障礙［20］。

5 MIRI中減輕OS相關的機制及通路

在生理條件下，細胞具有抗氧化防御系統，以防止ROS 造成損傷。通過抗氧化劑發揮作用的機制很多，如：①清除活性氧或其前體；②抑制ROS 的形成；③通過與金屬離子的結合減弱ROS 生成的催化作用；④增強內源性抗氧化生成；⑤通過上調抗凋亡基因Bcl-2 減少細胞凋亡。當組織處于缺血缺氧狀態時，氧自由基清除系統的功能會降低或消失，而其產生會增加［21］，因此可減輕OS。谷胱甘肽（GSH）是心臟中ROS 最重要的清除劑，谷胱甘肽過氧化物酶（GPX）可催化谷胱甘肽生成氧化谷胱甘肽（GSSG），將H2O2還原為H2O 或脂質過氧化氫（ROOH）進而生成穩定的醇。谷胱甘肽過氧化物酶（GPx）與谷胱甘肽還原酶（GSSG-R）一起維持低的GSH水平，保護細胞免受過氧化物損傷［22］。超氧化物歧化酶（SOD）亦是清除ROS 的重要物質，可將O2·-催化成細胞毒性較低的H2O2，最后被CAT 或GPx 系統轉化為水和氧分子，其他清除劑還包括硫氧還蛋白、維生素C、維生素E 等，通過他們的共同作用將ROS 濃度嚴格控制在較低的穩態水平［7］。但抗氧化劑在參與心臟病理生理過程中并不能識別特定來源的ROS，當氧化劑濃度超過細胞的適應能力時，細胞會經歷更嚴重的OS。線粒體在OS 過程中發揮重要作用，其中AMPK/SIRT1/PGC-1α 信號通路作為線粒體中充當能量傳導作用的通路，在線粒體生物合成、能量代謝和OS 中起重要的調節作用。Tilianin 可通過調節AMPK/SIRT1/PGC-1α 信號通路來改善線粒體能量代謝并減輕 OS，從而保護心肌 IRI 中的線粒體［23］。研究表明，ANG Ⅱ通過核AT1Rs 促進AT2R 信號級聯，包括線粒體AT2Rs 和Mas 受體的保護機制。核ANG Ⅱ受體的刺激通過過氧化物酶體增殖物激活受體γ 輔激活子1α 的抗氧化活性增強線粒體生物活動發生，并增加去乙酰化酶活性，從而保護細胞免受 OS［24］。減輕 OS 的機制：增強 eNOS 介導的 Keap1的亞硝基化，進而上調核Nrf2 和與Nrf2 相關的抗氧化信號通路，從而減輕 OS［25］；通過 cGMP-PKGI 的活化抑制 OS［26］；PI3K/Akt 信號的激活參與心臟 I/R 的保護，而OS 能通過影響PI3K/Akt 信號通路從而造成損害［27］。γ-谷氨酰轉肽酶（GGT）是一種異二聚體膜結合酶，通過水解和/或轉肽作用破壞γ-谷氨酰胺鍵，在細胞外還原型谷胱甘肽及其S-共軛物的代謝中發揮生理作用。GGT 抑制劑通過抑制GGT 活性和隨后的ROS 產生，對I/R 引起的心臟功能障礙發揮保護作用［28］。

綜上所述，OS 在MIRI 過程中起重要作用，其中ROS與OS密不可分。正常生理狀態下，抗氧化系統會將ROS 控制在較低水平，當組織缺血缺氧后，伴隨抗氧化系統功能的降低或消失，ROS產生增加，使得ROS 對細胞造成損傷。線粒體是產生ROS 的主要來源之一，ROS 通過直接對蛋白質、DNA、脂質造成損傷，并損傷線粒體、內質網等細胞器，進而促進細胞凋亡。ROS 還可通過促進炎癥級聯反應、炎性因子、促凋亡因子等釋放加強MIRI。